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蛋白质剪切是一种翻译后修饰事件,它将插入前体蛋白的中间的蛋白质内含子(intein)剪切出来,并用正常肽键将两侧蛋白质多肽链连接起来.在此过程中不需要辅酶或辅助因子的作用,仅需四步分子内反应.Intein及其侧翼序列可以通过突变产生高度特异性的自我切割用于蛋白质纯化、蛋白质连接和蛋白质环化反应,在蛋白质工程方面有广泛的应用前景.pTWIN载体在intein的N末端融合有chitin binding domain(CBD),它可使intein融合蛋白吸附于几丁质珠上.当将单链抗体(PG)融合到intein的C末端表达时,在pH值为7,温度为25℃的条件下,intein被诱导在其和目的蛋白之间进行自切割.这样,目的蛋白就被释放出来.基于intein自切割的蛋白纯化系统属于一次性纯化系统,该系统无需使用蛋白酶,避免了蛋白酶切割所带来的非特异性酶解,也无需进一步纯化去除蛋白酶,是一个省时经济的好方法.基因工程抗体在大肠杆菌中大量表达时,产物往往聚集成不溶的形式,即包涵体.这主要是因为基因工程抗体是在天然抗体分子的基础上构建的人工分子,其折叠成熟依赖于大肠杆菌的折叠酶和分子伴侣类蛋白,而组成型表达的辅助折叠分子不足以完成促进新生蛋白折叠的功能,所以在大肠杆菌中表达时容易形成不可溶的产物.由脯氨酸残基连接的肽键有顺式和反式两种,在天然蛋白质中,该肽键为反式结构.蛋白质在折叠过程中,需要将顺式异构化为反式,这也是蛋白折叠中的一个限速步骤,由肽基脯氨酸顺反异构酶来催化.一般认为,大肠杆菌肽基脯氨酸顺反异构酶在蛋白折叠起始中起重要作用,被称为Trigger Factor.FkpA属于大肠杆菌FKBP家族蛋白,是周质腔肽基脯氨酸顺反异构酶的一种.它有两种功能,有顺反异构和分子伴侣功能,确切的讲,FkpA能与早期折叠中间体结合并阻止它的聚合,因此能有效地促进目的蛋白的可溶表达.为提高可溶蛋白的比例,该研究在已构建的单链抗体pTWIN表达载体的基础上,引入FkpA,使其与单链抗体融合及共表达.结果显示PG融合蛋白对几丁质柱的吸附效率很高,intein的自切割释放PG的效率也较高,但PG仅出现在SDS洗脱液中.Western blot鉴定表明,抗膀胱癌单链抗体融合蛋白得到了正确表达并已被正确切割.FkpA与PG共表达能显著地提高目的蛋白的可溶性,而融合表达却没有提高目的蛋白的可溶性.