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第一部分:组蛋白甲基化酶SUV39H1抑制剂毛壳素抗肿瘤作用机制初探 尽管SUV39H1甲基化酶的发现已有多年，但对其生物学作用，尤其是在肿瘤发生和发展中的作用仍有待深入研究。近年来，关于SUV39H1与肿瘤相关的研究报导逐渐增多，毛壳素作为一个抗肿瘤的潜在药物也受到广泛关注，主要是对于白血病，骨髓瘤的抗肿瘤作用，对于艾滋病也有潜在的治疗作用。最新的研究表明毛壳素的抗肿瘤作用在实体瘤中更加显著。由此可见，SUV39H1抑制剂可能成为潜在的抗肿瘤药物。毛壳素能特异性抑制SUV39H1组蛋白甲基化酶，同时它分子结构中的二硫键能引起细胞的氧化应激反应，在细胞水平毛壳素可能影响多条信号通路。因此，毛壳素的抗肿瘤分子机制还不十分清楚。另一方面，获得专一性SUV39H1小分子抑制剂，对研究SUV39H1的生物学功能尤为重要。 因此我论文的第一部分工作就是: (一)建立SUV39H1甲基化酶抑制剂的筛选模型，以便用于后续筛选其特异性的小分子抑制剂; (二)利用天然产物毛壳素作为工具来初步探讨SUV39H1抑制剂毛壳素的抗肿瘤机制。 首先建立基于酶偶联反应的荧光法筛选模型，酶活性与荧光强度呈较好的线性关系，利用此法比较了不同片段长度的SUV39H1酶与商业出售的标准品的活性差异，并用此筛选模型检测了毛壳素的IC5o，与文献报道值接近。 我们选择缺乏有效治疗手段和药物的三阴乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)研究毛壳素的抗肿瘤机制以及与一线药物阿霉素联用的药理效应。我们用SRB的方法分别检测了毛壳素与阿霉素对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用。两种药物均显示出较好的抑制增殖作用。在一定浓度下联合用药两种药物显示出比较好的协同效应。 我们用western blot检测了毛壳素与阿霉素以及联合用药对MDA-MB-231细胞上SUV39H1酶催化的组蛋白H3K9三甲基化水平的影响。毛壳素0.2μM处理24小时，能降低细胞H3K9me3水平，毛壳素随浓度增加能进一步降低细胞H3K9me3水平。阿霉素单独用药对细胞H3K9me3水平无明显改变，当阿霉素与毛壳素联合用药能显著降低细胞H3K9me3水平。 我们用流式细胞术检测了两种药物及联合用药对MDA-MB-231细胞周期的影响。毛壳素能引起细胞周期阻滞在G2/M期，阿霉素作用于DNA合成期因此细胞周期被阻滞在S期;联合用药后，相对于单用阿霉素S期细胞比例减少，G1期与G2/M细胞比例增多。 我们又用流式细胞术检测了两药及联合用药对MDA-MB-231细胞凋亡的作用。毛壳素处理细胞能引起细胞凋亡，并呈浓度时间正相关。阿霉素处理细胞24h凋亡诱导作用不显著，当两种药物联合处理细胞时，凋亡细胞比例明显增多。我们同时检测了凋亡通路中的caspase-3酶活性水平，以及用western blot检测了caspase-3催化切割的底物PARP及切割产物cleaved PARP的水平。毛壳素本身能提高caspase-3的酶活性，cleaved PARP水平也明显增加;阿霉素与毛壳素联用时，能进一步提高caspase-3的酶活性及增加cleaved PARP水平。上述的结果提示毛壳素以及与阿霉素联用可能激活了凋亡通路，进而诱导细胞走向凋亡。 第二部分:黄芩苷激活AMPK的机制研究 本实验室之前的研究表明黄芩苷通过磷酸化激活AMPK有效减轻肥胖大鼠的代谢失调和肝脏脂肪变性，并且本实验室合成的新型黄芩苷衍生物在LKB1缺失的HeLa细胞系中能通过磷酸化AMPK而抑制细胞增殖和诱导凋亡。因此，我论文的第二部分工作是选择了LKB1缺失的HeLa细胞，通过检测细胞内Ca2+浓度、AMPK上游激酶CaMKKβ活性对黄芩苷激活AMPK的影响，来探讨黄芩苷调控AMPK的分子机制。黄芩苷1μM、5μM处理HeLa细胞0.5、1、3、6小时，p-AMPK明显增加，同时其下游靶标ACC的磷酸化产物p-ACC也明显增加.因此，黄芩苷对AMPK的激活是一个不依赖于LKB1的过程。 为研究另一AMPK上游激酶CaMKKβ在黄芩苷激活AMPK中的作用，我们检测了黄芩苷对细胞钙水平的影响。黄芩苷5μM处理1h，细胞内Ca2+浓度缓慢持续增高，达到峰值后趋于稳定。用螯合剂螯合细胞内游离Ca2+能显著减少黄芩苷激活AMPK而产生的磷酸化p-AMPK。由此可见，胞内的Ca2+对黄芩苷激活AMPK是必需的。 为进一步验证CaMKKβ为黄芩苷激活AMPK的分子途径，我们用选择性CaMKKβ抑制剂STO-609处理HeLa细胞，不再能观察到单用黄芩苷处理细胞产生的p-AMPK及p-ACC增加的现象。并且阻断Ca2+/CaMKKβ其中之一均能抑制黄芩苷对于CaMKKβ另一下游底物CaMKI的磷酸化。更重要的是，抑制CaMKKβ之后，黄芩苷不再有明显的降脂作用。因此，黄芩苷激活AMPK并参与代谢调节是一个依赖CaMKKβ的过程。