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胶质源性神经营养因子(GDNF)是一种能够特异性作用于多巴胺能神经元并对其发挥营养和保护作用的神经营养因子。大量的实验研究和临床研究都证实，局部给予或过表达GDNF能够改善帕金森病的症状，阻止黑质多巴胺能神经元发生退行性变，并能够促进突触的重建。但由于GDNF作为一种大分子的蛋白质难以通过血脑屏障且过量应用有一定副作用，其实际应用于临床的研究一直没有取得突破性的进展。近来的研究表明GDNF基因修饰的细胞移植治疗可以明显改善帕金森动物模型的症状。而人胚胎神经干细胞(NSC)在体外培养条件下能够自我增殖和自主分化，在体移植条件下能够在移植区存活并迁移分化成多种神经细胞，这些特性使其成为神经退行性疾病细胞移植治疗的良好载体。本研究利用一种可调控的慢病毒载体对神经干细胞进行了GDNF基因修饰，使其过表达GDNF，实验过程中，对以下几个问题进行了探讨。
首先利用同时含有GDNF基因和潮霉素(Hygromycin)抗性基因的慢病毒载体转染了人胚胎皮层来源的神经干细胞，并对转染后hNSC GDNF的表达分泌水平进行了测定。方法：利用分子克隆的方法将GDNF基因克隆入慢病毒载体DUET101中，由管家基因启动子EFl-α驱动，潮霉素抗性基因由启动子PGK驱动。通过脂质体介导的三种质粒共同进行瞬时转染的方法包装出慢病毒载体上清，滴度鉴定后按不同转染拷贝数转染hNSC。ELISA方法测定GDNF分泌水平。Real-time PCR方法测定了不同转染拷贝数条件下GDNF mRNA水平。
结果：含GDNF基因的慢病毒载体可以成功转染hNSC，经潮霉素筛选后可以得到更为均一的高表达GDNF的细胞体系。转染拷贝数越高，GDNF分泌量越高。GDNF可持续高表达三个月以上。其次，利用可调控的慢病毒载体对GDNF在hNSC中的体外表达调控进行了研究。方法：经过潮霉素筛选的hNSC再次转染DUET-TTS-RFP后，转染成功的hNSC会表达转录抑制蛋白TTS和红色荧光蛋白RFP。TTS与TetO7结合，GDNF的转录被抑制。在细胞培养基中加入强力霉素(Doxycycline，DOX)后，TTS与TetO7解离，GDNF转录被激活。停止给予强力霉素后，GDNF的转录再次被抑制。在给予不同浓度DOX(1ng/ml，5ng/ml，20ng/ml，50ng/ml)的情况下测定了GDNF的分泌水平。实验结果表明，TTS可以在体外条件下抑制GDNF转录，GDNF表达分泌水平下调，再给予一定浓度的DOX可以激活GDNF转录，使GDNF表达分泌恢复到原来水平。此调控的过程可以多次重复。
最后，为了鉴定慢病毒载体介导的GDNF基因修饰对hNSC的生物学特性有无影响，对转染后hNSC生物学特性进行了分析。方法：细胞计数和Brdu掺入法测定细胞增殖有无变化；去生长因子自主分化，免疫组化测定Tuj-1阳性细胞比例测定细胞分化特性；放线菌素D诱导凋亡，测定凋亡率有无变化。结果：转染GDNF对hNSC具有一定的保护作用。表现为转染GDNF的hNSC放线菌素D诱导凋亡比率低于对照组，说明GDNF有减少凋亡的作用。另外转染GDNF后的hNSC体外自主分化成Tuj-1阳性神经元的比例高于同期未转染组，但与hNSC培养初期神经元的分化比例相当。
结论：研究证实，hNSC在含有GDNF基因的慢病毒载体进行基因修饰的条件下能够持续高表达GDNF。在体外培养条件下，hNSC GDNF的表达分泌可以通过四环素调控系统进行表达调控。另外，慢病毒载体介导的基因修饰对hNSC增殖特性没有明显改变。转染GDNF后，hNSC的凋亡水平下降，分化成为Tuj-1阳性神经元的比例高于同期未转染组，与培养初期hNSC的神经元分化比例相当，说明GDNF对hNSC的凋亡发生和自主分化有一定影响。