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猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪严重的腹泻并可导致仔猪死亡,尤其是2周龄以内仔猪死亡率高达100%,很容易和其它肠道病毒发生混合感染,并且和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的临床症状极为相似,给病原的检测造成困扰。本实验用抗TGEV重组N蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体建立一种捕获抗原的双抗体夹心ELISA检测方法,经过检验,效果良好,可以做为病原诊断的可靠简便的方法。本研究从以下几个方面展开:1、抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的制备。利用大肠杆菌原核表达系统表达TGEV重组N蛋白,经过纯化和鉴定后免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞按常规方法融合筛选后得到2株能稳定分泌抗重组N蛋白抗体的杂交瘤细胞株2G7和2C2。2株单抗亚类均为IgG1;间接免疫荧光表明2株单抗能识别细胞中的TGEV,感染细胞呈现亮绿色荧光;杂交瘤细胞培养上清效价稳定在1:12800;腹水的间接ELISA效价均为1:10~8。结果表明2株单抗细胞株遗传稳定,分泌的抗体特异性好。2、抗TGEV全病毒和重组N蛋白多抗血清的制备。将纯化的病毒和重组N蛋白分别免疫家兔,采集血清经过蛋白A亲和层析纯化得到2种多抗血清,间接ELISA效价分别为1:204800和1:25600,BCA方法测定浓度分别为51.64mg/ml和37.28mg/ml。3、双抗体夹心ELISA检测方法的建立。将2株单抗和2种多抗分别配对,结果显示2C2单抗为捕获抗体,N蛋白多抗为检测抗体时检测效果最好。优化条件为:2C2单抗稀释1000倍于37℃包被2h,N蛋白多抗稀释1000倍37℃孵育1h,病毒抗原37℃孵育2h,酶标抗体稀释2000倍在37℃反应30min,底物于室温显色15min。建立好的检测方法经过特异性、敏感性和重复性等检测,表明该方法能特异地捕获TGEV的抗原并和PEDV、PRV没有交叉反应,能检出的病毒最低浓度为13.37μg/ml,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,重复性良好。