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马铃薯(Solanum tuberosum L.)被认为是全球第四大粮食作物和主要的非谷物作物。由致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)引致的晚疫病是世界上毁灭性的马铃薯病害，威胁马铃薯的可持续生产。利用品种抗病基因(R)是晚疫病防控的最有效方法。然而，由于抗病资源较少，并且致病疫霉菌的毒性变异能力强，导致品种抗病性的丧失问题突出，使得晚疫病防控高度依赖杀菌剂的应用。本研究采用了根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的瞬时基因表达法和生物学方法，研究具有多年优良田间晚疫病抗性表现的马铃薯品种，以期解析其晚疫病抗性的遗传基础，鉴定新的抗晚疫病基因，为马铃薯抗晚疫病育种奠定基础。主要研究结果如下：
1.根癌农杆菌介导的马铃薯瞬时基因表达技术的建议和条件优化：利用组培苗进行农杆菌介导的马铃薯瞬时基因表达试验。为了评估影响农杆菌瞬时表达的因素，设置了三个参数，包括不同的根癌农杆菌菌株(AGL1和GV3101)，农杆菌浓度(OD600值为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6)以及不同的生长苗龄的马铃薯组培苗(3-4、6-7和9-10周龄)。在本研究中基因瞬时表达效率最高的条件为，使用农杆菌菌株AGL1(OD600为0.4)和苗龄为3-4或9-10周的幼苗。我们利用最佳条件，对这两个马铃薯品种进行了分析，以了解它们识别致病疫霉菌已知效应基因的能力。
2.通过瞬时表达致病疫霉菌RxLR效应基因(10个已知的无毒基因和16个核心RxLR效应基因)来检测R基因。通过瞬时表达致病疫霉菌效应基因来筛选西北地区的两个主要马铃薯品种，青薯9号和陇薯7号。10个已知的致病疫霉菌无毒基因，包括PiAvr1,PiAvr2,PiAvr3aKI,PiAvr3b,PiAvr4,PiAvrblb1,PiAvrblb2,PiAvrsmira1,PiAvr8(PiAvrsmira2)和PiAvrvnt1.1。结果表明，PiAvr4和PiAvr8(PiAvrsmira2)均可在青薯9号上诱导HR反应，而PiAvrvnt1.1在陇薯7号激活细胞死亡。此外，在16个核心RxLR效应基因中，E34和E239在青薯9号注射后引发过敏性坏死反应，而E13，E34和E119-2在陇薯7号注射后激活HR介导的细胞死亡。这些发现表明，这两个品种都具有重要的R基因，可以增强马铃薯识别某些病原菌效应基因的能力并抑制其侵染。值得注意的是，我们的研究还表明，PiAvr3aEM能被这两个马铃薯品种所识别，但是，在青薯9号和陇薯7号上PiAvr3aKI不能诱导HR反应。这种识别可能涉及它在晚疫病抗性方面的重要田间表现。通过对青薯9号和陇薯7号识别致病疫霉菌效应基因PiAvr3aEM介导的天然抗性的鉴定，加速育种进程，提高马铃薯对致病疫霉菌的抗性。
3.通过遗传杂交和后代分析，对PiAvr3aEM识别进行了初步鉴定。采用经典遗传方法研究了两个品种识别PiAvr3aEM的遗传基础。我们测试以青薯9号或陇薯7号作为亲本，和对PiAvr3aEM无HR反应的马铃薯作为另一亲本的杂交后代。统计在后代材料瞬时表达PiAvr3aEM的反应。评估了九个杂交的后代，包括与陇薯7号(CIP01，CIP03，CIP16，CIP30和CIPL06408)的五个杂交后代，以及与青薯9号的四个杂交后代(Qingshu2，ND，NSS1-5和Jizhang8)。在陇薯7号杂交的两个后代上发现PiAvr3aEM诱导的HR反应，而青薯9号只有一个杂交后代出现了HR反应，表明这两个品种，对PiAvr3aEM的识别很可能都由单个基因R3a*决定且具有单一基因型。此外，在离体马铃薯叶片上，利用六种已知毒力的致病疫霉菌株(PjY009,PjY048,PjY061,Pa21106,Pd21410和F48)进行室内接菌测试。青薯9号对Pa21106，Pd21410和F48有高度抗性(R)，但对PjY009，PjY048和PjY061有感病性(S)。陇薯7号对PjY061，Pa21106，Pd21410和F48有抗性，但对PjY009和PjY048敏感。
综上所述，通过检测一些R基因并鉴定出可以介导识别PiAvr3aEM的新R基因揭示了两个有潜在抗性的品种青薯9号和陇薯7号的关键抗性机制，表明效应基因筛选应用于马铃薯育种的有用性，对探究马铃薯晚疫病抗性有重要意义。
1.根癌农杆菌介导的马铃薯瞬时基因表达技术的建议和条件优化：利用组培苗进行农杆菌介导的马铃薯瞬时基因表达试验。为了评估影响农杆菌瞬时表达的因素，设置了三个参数，包括不同的根癌农杆菌菌株(AGL1和GV3101)，农杆菌浓度(OD600值为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6)以及不同的生长苗龄的马铃薯组培苗(3-4、6-7和9-10周龄)。在本研究中基因瞬时表达效率最高的条件为，使用农杆菌菌株AGL1(OD600为0.4)和苗龄为3-4或9-10周的幼苗。我们利用最佳条件，对这两个马铃薯品种进行了分析，以了解它们识别致病疫霉菌已知效应基因的能力。
2.通过瞬时表达致病疫霉菌RxLR效应基因(10个已知的无毒基因和16个核心RxLR效应基因)来检测R基因。通过瞬时表达致病疫霉菌效应基因来筛选西北地区的两个主要马铃薯品种，青薯9号和陇薯7号。10个已知的致病疫霉菌无毒基因，包括PiAvr1,PiAvr2,PiAvr3aKI,PiAvr3b,PiAvr4,PiAvrblb1,PiAvrblb2,PiAvrsmira1,PiAvr8(PiAvrsmira2)和PiAvrvnt1.1。结果表明，PiAvr4和PiAvr8(PiAvrsmira2)均可在青薯9号上诱导HR反应，而PiAvrvnt1.1在陇薯7号激活细胞死亡。此外，在16个核心RxLR效应基因中，E34和E239在青薯9号注射后引发过敏性坏死反应，而E13，E34和E119-2在陇薯7号注射后激活HR介导的细胞死亡。这些发现表明，这两个品种都具有重要的R基因，可以增强马铃薯识别某些病原菌效应基因的能力并抑制其侵染。值得注意的是，我们的研究还表明，PiAvr3aEM能被这两个马铃薯品种所识别，但是，在青薯9号和陇薯7号上PiAvr3aKI不能诱导HR反应。这种识别可能涉及它在晚疫病抗性方面的重要田间表现。通过对青薯9号和陇薯7号识别致病疫霉菌效应基因PiAvr3aEM介导的天然抗性的鉴定，加速育种进程，提高马铃薯对致病疫霉菌的抗性。
3.通过遗传杂交和后代分析，对PiAvr3aEM识别进行了初步鉴定。采用经典遗传方法研究了两个品种识别PiAvr3aEM的遗传基础。我们测试以青薯9号或陇薯7号作为亲本，和对PiAvr3aEM无HR反应的马铃薯作为另一亲本的杂交后代。统计在后代材料瞬时表达PiAvr3aEM的反应。评估了九个杂交的后代，包括与陇薯7号(CIP01，CIP03，CIP16，CIP30和CIPL06408)的五个杂交后代，以及与青薯9号的四个杂交后代(Qingshu2，ND，NSS1-5和Jizhang8)。在陇薯7号杂交的两个后代上发现PiAvr3aEM诱导的HR反应，而青薯9号只有一个杂交后代出现了HR反应，表明这两个品种，对PiAvr3aEM的识别很可能都由单个基因R3a*决定且具有单一基因型。此外，在离体马铃薯叶片上，利用六种已知毒力的致病疫霉菌株(PjY009,PjY048,PjY061,Pa21106,Pd21410和F48)进行室内接菌测试。青薯9号对Pa21106，Pd21410和F48有高度抗性(R)，但对PjY009，PjY048和PjY061有感病性(S)。陇薯7号对PjY061，Pa21106，Pd21410和F48有抗性，但对PjY009和PjY048敏感。
综上所述，通过检测一些R基因并鉴定出可以介导识别PiAvr3aEM的新R基因揭示了两个有潜在抗性的品种青薯9号和陇薯7号的关键抗性机制，表明效应基因筛选应用于马铃薯育种的有用性，对探究马铃薯晚疫病抗性有重要意义。