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本研究以雌性地鳖虫为原料,经过pH7.4、0.01mol/L磷酸钠缓冲液过夜提取,4000r/min离心20min,去沉淀,上清液用硫酸铵盐析法提取蛋白质,收集40%-65%饱和度蛋白质盐析组分,透析除盐得到粗蛋白。用自动核酸蛋白分离层析仪分离并收集蛋白质组分,洗脱是通过使用含有1.0mol/L氯化钠的0.02mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液梯度洗脱,恒流泵流速调整为0.6ml/min,自动部分收集器调整为10min收集一管。收集两组蛋白质峰,并且通过真空冷冻干燥法将蛋白质冻成粉末,存放于-20℃备用。
⑴将提取所得的蛋白质粉末,用pH7.4的磷酸钠缓冲液稀释成特定浓度,利用纤维蛋白平板法分别检测所收集的两种蛋白质的纤溶活性。经过检测,两组蛋白质均有纤溶活性,同时也具有纤溶激酶活性。因此,两组蛋白质均是纤溶活性蛋白,分别将两组蛋白质命名为地鳖虫纤溶活性蛋白组分Ⅰ(EFP-Ⅰ)和地鳖虫纤溶活性蛋白组分Ⅱ(EFP-Ⅱ)。通过SDS-PAGE电泳检测地鳖虫纯度检验,结果均呈现单一条带,参照标准分子量蛋白(mark),EFP-Ⅰ和EFP-Ⅱ的分子量分别为31.9 kD和41.3kD,并且两种蛋白质均是单亚基结构,因此,EFP-Ⅰ和EFP-Ⅱ有可能地鳖虫的同一类纤溶酶。
⑵对EFP的相关性质进行研究,结果表明:EFP的热稳定性较差,40℃温浴30min其纤溶活力降到0.8U;EFP的纤溶活性受温度的影响显著,最适作用温度约为40℃;EFP的纤溶活性受pH影响较为显著,其作用的最适pH值为8.0;Na+和K+对EFP的纤溶活力基本无影响,而Mg2+和Ca2+则对其活力有较强的抑制作用;1mg/ml的尿素、巯基乙醇、EDTA和PMSF变性剂对EFP的活性均具有很强的抑制作用。
⑶采用MTT法检测EFP在体外对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制作用,结果显示EFP在体外能显著抑制人舌癌细胞Tea-8113的增殖,并且呈现明显的药物剂量和时间依赖关系。5个EFP浓度(0.0101g/ml,0.0302g/ml,0.0501g/ml,0.0702g/ml和0.0902g/ml)处理组在3个处理时间内,舌癌Tea-8113细胞增殖被抑制的情况为:24h后,细胞增殖抑制率分别为8.53%,16.37%,26.96%,53.14%和92.06%;48 h后,细胞增殖抑制率分别为-4.71%,10.91%,33.14%,84.22%和91.90%;72 h后,细胞增殖抑制率分别为6.51%,37.07%,46.92%,69.58%和92.96%。
⑷采用生长曲线法测定EFP对常见病原菌的作用,结果显示:EFP对大肠杆菌的对数期和稳定期生长曲线几乎不产生影响,因此,EFP对大肠杆菌可能不产生影响;EFP促使金黄色葡萄球菌的对数生长期提前了约30min,稳定期的金黄色葡萄球菌的数量略低于对照组金黄色葡萄球菌的数量;EFP对副溶血弧菌有较强的促进增殖作用。