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前列腺癌(Prostate Cancer)是目前全世界最常见的男性恶性肿瘤之一,在美国等发达国家癌症致死率排名中位居第二位。我国近年来前列腺癌发病率也呈现逐年上升趋势,因此,针对前列腺癌开展有效的防治措施具有重大的社会意义和经济效益。前列腺癌起病隐匿,生长较为缓慢,早期前列腺癌可无任何临床症状。而一旦出现症状,常属较晚期的进展性前列腺癌,就诊时多数患者已发生远处转移。前列腺癌恶性程度高,发病机制至今尚未完全明确,年龄、种族及遗传家族史均与发病密切相关。对于早期局限性前列腺癌,综合考虑患者年龄、肿瘤临床分期、血清前列腺特异性抗原、格里森评分及前列腺活检阳性标本数量等多种因素,可以选择主动监测或根治性前列腺癌切除术。但如前文所述,前列腺癌起病隐匿,多数患者就诊时已发生远处转移,错失手术根治的机会。由于86-98%的前列腺癌为雄激素依赖型肿瘤,目前针对晚期转移性前列腺癌的经典治疗策略是雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy,ADT),也称为去势疗法,但多数患者在1-2年内对ADT发生耐药,进展为转移性去势抵抗型前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer,mCRPC)。新近研发的ADT药物恩杂鲁胺及阿比特龙可明显改善患者生存率,被认为是mCRPC治疗方面的突破进展,但20-40%的患者对恩杂鲁胺及阿比特龙并不敏感(原发耐受),其余敏感患者最终也几乎都会出现继发耐受。化疗也是前列腺癌主要的治疗方法之一,可以延长患者的生存时间。但化疗药物均有一定药物毒性,身体状态、骨髓功能或肝肾功能较差的患者通常不能耐受。免疫疗法(如sipuleucel-T)为mCRPC的治疗提供了新的方向,但相对严格的使用适应症和较高的经济成本限制其使用。目前已有大量的治疗前列腺癌的新药进行动物实验,甚至进入临床试验阶段,如卡博替尼(一种酪氨酸激酶抑制剂)。然而,这些新药从研发到临床还需要数年的时间。因此,寻找一种安全、有效的药物治疗方法仍然是目前前列腺癌治疗中需要迫切解决的问题。非诺贝特作为一种降脂药物,已经广泛应用于临床。其化学成分为2-甲基-2-[4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基]丙酸异丙酯,它药效稳定、使用安全、价格低廉,已被临床广泛应用于高胆固醇血症和高脂血症的治疗。此外,非诺贝特还被证实具有预防糖尿病视网膜病变、糖尿病肾脏病变、糖尿病心肌病变,以及其他糖尿病微血管并发症的作用。越来越多的研究证明非诺贝特在某些恶性肿瘤的发生过程中还具有抗肿瘤细胞增殖和促肿瘤细胞凋亡的作用,如乳腺癌、子宫颈癌症、肝癌和前列腺癌。已有报道发现非诺贝特可通过激活氧化应激反应,来抑制雄激素受体表达水平并诱导细胞凋亡,从而发挥抑制雄激素依赖型前列腺癌细胞系LNCaP的生长的作用。目前,治疗mCRPC是临床治疗前列腺癌的难点,也是国内外研究热点。因此,本论文主要探讨非诺贝特是否能够抑制雄激素非依赖型前列腺癌PC-3细胞(可模拟临床mCRPC)生长及相关分子机制,并通过动物实验进一步验证。本论文所得到的结果如下:(1)MTT法测定PC-3细胞在不同浓度的非诺贝特作用24、48和72 h的增殖情况。结果显示,非诺贝特明显抑制PC-3细胞的生长,且这种抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性。(2)应用流式细胞术分析非诺贝特引起的细胞凋亡情况。结果显示,非诺贝特处理24、48及72 h的凋亡细胞总百分比分别为8.5±1.87%,12.63±2.59%和25.53±7.77%,较对照组3.83±0.64%明显升高。进一步检测细胞凋亡的两个重要指标caspase 3和AIF。结果显示,非诺贝特处理24小时后明显增加了cleaved caspase 3和AIF的表达。上述结果说明非诺贝特抑制PC-3细胞生长主要是通过激活caspase3和AIF从而诱导细胞凋亡实现的。(3)非诺贝特处理PC-3细胞后,Bad表达升高,Bcl-2和Survivin表达降低。说明非诺贝特通过提高Bad的表达,降低Bcl-2和survivin的表达,诱导PC-3细胞凋亡。(4)非诺贝特处理PC-3细胞0.5-24 h,p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K比值明显下降。100nM雷帕霉素(mTOR抑制剂)处理后,非诺贝特的抗增殖作用与雷帕霉素相同,且雷帕霉素能够进一步提高非诺贝特的抗增殖能力。说明抑制mTOR的磷酸化可以抑制PC-3细胞增殖,非诺贝特抑制PC-3细胞增殖是通过抑制mTOR/p70S6K细胞通路实现的。(5)非诺贝特处理PC-3细胞后没有激活PI3K,但作用0.5 h及48 h时p-AKT/AKT比值升高。非诺贝特处理0.5 h至48 h时p-P38/P38比值增加,但对JNK表达没有影响。非诺贝特处理0.5 h至3 h时p-AMPKα/AMPKα比值明显降低,但作用24h时p-AMPKα/AMPKα比值明显升高。上述结果说明非诺贝特对mTOR/p70S6K通路的抑制作用不通过PI3K/AKT及JNK通路,可能与增加P38 MAPK和AMPKα磷酸化有关。(6)10μM SB203580(P38 MAPK抑制剂)没有消除非诺贝特对PC-3细胞的生长抑制作用,反而明显提高了非诺贝特的抗增殖能力。同样,5μM Compound C(AMPK抑制剂)也没有消除非诺贝特对PC-3细胞的生长抑制作用,反而明显提高了非诺贝特的抗增殖能力。说明非诺贝特对mTOR/p70S6K通路的抑制作用不通过P38 MAPK和AMPKα通路,但抑制P38 MAPK和AMPK明显增加了非诺贝特对PC-3细胞的生长抑制作用。(7)将2×10~6/0.1ml的PC-3细胞悬液接种于裸鼠背部皮下,构建前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。当肿瘤体积达到100mm~3时,将裸鼠分组进行实验。非诺贝特溶液200mg/kg每日1次灌胃3周后,药物组肿瘤体积、肿瘤重量及肿瘤重量/体重比值较对照组明显下降,但两组裸鼠体重未见明显差异,说明非诺贝特对移植瘤有抑制作用,且未见明显副作用。本论文得出了如下的结论:(1)非诺贝特抑制PC-3细胞的生长,且这种抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性;(2)非诺贝特抑制PC-3细胞生长主要是通过抑制mTOR/p70S6K细胞通路来诱导细胞凋亡实现的。非诺贝特抑制mTOR磷酸化,继而减少P70S6K激活,引起Bad表达增多与Bcl-2表达降低,通过线粒体途径激活caspase3并增加AIF释放,最终诱导细胞凋亡。P70S6K激活减少同时引起survivin表达量降低,caspase3激活增加,诱导细胞凋亡;(3)非诺贝特对mTOR/p70S6K通路的抑制作用不通过PI3K/AKT、MAPKs和AMPK通路,但抑制P38 MAPK和AMPK明显增加了非诺贝特对PC-3细胞的生长抑制作用;(4)非诺贝特对前列腺癌裸鼠皮下移植瘤具有抑制作用,且未见明显副作用。