论文部分内容阅读
多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是以炎细胞浸润、髓鞘脱失和继发轴索损伤为主要特征的中枢神经系统(central nerves system,CNS)自身免疫性脱髓鞘疾病。MS的病因复杂,涉及环境、遗传易感性等诸多因素。尽管其发病机制尚未完全阐明,但越来越多的证据表明,抗原特异性Th17细胞介导的异常免疫反应和执行免疫耐受的调节性T细胞(Treg)的功能异常在MS的发病机制中起到重要作用。Th17细胞在外周免疫器官的生成及其向CNS的浸润,在MS和实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的发病机制中都起到重要的作用。Th17细胞及其特征性细胞因子interleukin(IL)-17通过多种机制参与MS病理损伤过程,IL-17可以通过与血脑屏障(blood–brain barrier,BBB)中内皮细胞表达的IL-17R结合,减少紧密结合蛋白表达而破坏BBB,促进炎细胞向中枢神经系统浸润,诱导促炎因子生成等多种途径进一步加重免疫反应。而Treg细胞可以通过细胞接触依赖的途径来达到对自身反应效应T细胞活化和增殖的控制。外界抗原等刺激可以使淋巴细胞向不同的细胞功能亚群分化,不同功能的T细胞亚群需要不同的能量和生物合成途径来维持其特殊功能需要。随着不断的研究,细胞代谢已经被认为是T细胞特殊功能的重要调节因素,在激活的效应T细胞中为满足生物合成的需要和产生足够的能量,细胞代谢方式从以氧化磷酸化为主向有氧糖酵解为主转换。相反,在静止T细胞和Treg细胞中,氧化磷酸化却作为主要能量供应代谢方式。哺乳动物雷帕霉素靶(Mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种进化保守的丝氨酸苏氨酸激酶,除了在调节细胞生长、增殖、存活、代谢等方面起作用外,在辅助T细胞的活化和分化过程中也具有至关重要的作用。mTOR及其下游低氧诱导因子-1α(hypoxia inducer factor-1α,HIF-1α)参与的糖酵解代谢在Th17细胞的分化发展过程中起到重要作用。HIF-1α还调节多种参与糖酵解代谢的基因,包括葡萄糖转运蛋白1(glucose transportprotein1,glut1)、丙酮酸激酶m2(pyruvatekinasem2,pkm2),而这些基因编码了参与调节糖酵解代谢的酶,并在效应t细胞的分化及功能决定过程中起作用。腺苷酸激活蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase,ampk)是受多种代谢刺激调控的高度保守的细胞能量感受器,ampk和mtor在调节细胞代谢和免疫的信号连接途径中起到相反的作用,ampk可以通过磷酸化结节性硬化复合体2(tuberoussclerosiscomplex2,tsc2)、mtorc1的结构蛋白raptor来抑制mtor的功能。ampk可以通过抑制mtor介导的糖酵解代谢和调节脂质代谢进而影响th17细胞和treg细胞的产生。二甲双胍(metformin,met)是广泛应用于2型糖尿病的一线临床用药。它的药理作用和ampk的激活有关。二甲双胍除了降糖作用外,在抗炎、抗氧化、辅助巨噬细胞向不同类型转换等方面的作用逐渐被人们关注,并已有用于治疗除糖尿病外的多种疾病的实验研究。基于mtor及ampk的相互作用及其通路对于效应t细胞的可能作用,我们考虑met可能对eae具有保护作用,且这种保护作用是通过对于t细胞的调节达到的。在我们的研究中,我们利用mog35-55免疫c57bl/6小鼠制备eae模型,观察给予met干预是否对于eae具有保护作用,以及它对eae模型中th17细胞和treg细胞反应的影响,并对met是否通过调节mtor/hif-1α通路来进一步调节th17/treg细胞平衡进行研究。第一部分二甲双胍通过调节th17/treg细胞平衡改善实验性自身免疫脑脊髓炎病情目的:建立c57bl/6小鼠eae模型,应用二甲双胍干预,观察用药干预组和eae模型组发病情况及脊髓中炎性细胞浸润情况,观察两组中th17细胞和treg细胞数量变化及相应的特征性炎症因子、转录因子的变化。方法:1采用近交系雌性c57bl/6小鼠作为实验动物,周龄8-10周,体重为18-20g。应用mog35-55作为抗原,与完全弗氏佐剂和结核菌素混合后给予小鼠背部皮下注射,并于免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(ptx),建立eae动物模型。2将雌性c57bl/6小鼠随机分为正常对照组、eae模型组和met治疗组。自免疫后第1天(免疫当日记作第0天)开始,met治疗组小鼠给予每日腹腔注射met100mg/kg,正常对照组及eae模型组小鼠每日腹腔注射等量的生理盐水。自免疫日开始,每日给予小鼠两次神经功能评分,并测量体重,连续观察30天,神经功能评分采用knoz评分法。3应用he染色对小鼠脊髓切片进行染色,观察脊髓组织中炎性细胞浸润程度。4应用流式细胞检测技术检测各组小鼠脾细胞培养悬液中th17细胞和treg细胞的比例。5应用elisa检测方法检测脾细胞培养上清中的炎症因子il-17a、il-10、tgf-β含量。6应用qpcr方法检测小鼠脾组织及脊髓组织中炎症因子il-17a、il-10、tgf-βmrna转录水平和th17细胞和treg细胞特异性转录因子rorγt、foxp3mrna转录水平。7采用spss16.0统计软件进行统计分析。实验数据以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。发病率用卡方检验进行统计学分析,以百分比表示。临床神经功能评分用mann–whitneyu检验。多组计量资料均数的比较:方差齐时应用one-way-anova中snk-q检验进行方差分析,方差不齐时应用非参数秩和检验。以p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1met对于eae发病率及临床评分的影:met降低了eae的发病率(p<0.05)并改善了eae发病的临床症状(p<0.01)。2met减少eae中枢神经系统炎性细胞浸润:发病高峰期eae模型组小鼠脊髓组织炎症评分较met治疗组比较明显增加(p<0.01)。3met减轻eae中th17细胞反应:流式细胞检测th17细胞含量显示met治疗组th17细胞比例较eae模型组下降(p<0.01)。elisa检测脾细胞上清培养液中il-17a含量显示met治疗组细胞因子il-17a含量低于eae模型组(p<0.01)。qpcr检测结果显示脾组织中th17细胞的特征性转录因子rorγtmrna转录水平在met治疗组下降(p<0.01)。在中枢神经系统中,il-17a和rorγtmrna转录水平在met治疗组中下降(p<0.01)。4met促进了eae中treg细胞反应:流式细胞检测treg细胞含量显示met治疗组treg细胞比例较eae模型组提高(p<0.01)。elisa检测脾细胞上清培养液中il-10、tgf-β显示met治疗组细胞因子含量高于eae模型组(p<0.01)。qpcr检测结果显示脾组织中il-10、tgf-β和foxp3mrna转录水平在met治疗组中提高(p<0.01)。在中枢神经系统中,il-10、tgf-β和foxp3mrna转录水平在met治疗组中提高(p<0.01)。第二部分ampk/mtor信号通路中涉及代谢的分子在实验性自身免疫性脑脊髓炎疾病中的动态变化目的:建立c57bl/6小鼠eae模型,按照疾病模型发病规律将病程分为发病初期、发病高峰期、疾病缓解期,在发病各个时期检测ampk及mtor/hif-1α通路参与细胞代谢的hif-1α、glut1、pkm2的表达情况。方法:1采用近交系雌性c57bl/6小鼠作为实验动物,周龄8-10周,体重为18-20g。应用mog35-55作为抗原,与完全弗氏佐剂和结核菌素混合后给予小鼠背部皮下注射,并于免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(ptx),建立eae动物模型。自免疫日开始,每日给予小鼠两次神经功能评分,并测量体重连续观察30天,神经功能评分采用knoz评分法。2根据疾病病程在发病初期(免疫后13d)、发病高峰期(免疫后20d)、疾病缓解期(免疫后30d)分别对eae小鼠脾组织进行取材,应用westernblot方法检测脾组织中ampk、qampk、hif-1α蛋白表达,应用qpcr检测方法检测脾组织中hif-1α、glut1、pkm2及th17细胞特征性细胞因子il-17,特征性转录因子rorγt,treg细胞特征性转录因子foxp3mrna转录水平。3采用spss16.0统计软件进行统计分析。实验数据以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。多组计量资料均数的比较:方差齐时应用one-way-anova中snk-q检验进行方差分析,方差不齐时应用非参数秩和检验。以p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1eae发病情况:eae组小鼠的发病率为100%,平均发病时间为12.40±1.83天,平均达峰时间为19.0±1.25天。高峰期神经功能评分2.85±0.24分。2hif-1α在疾病发病过程中的变化:westernblot结果显示发病初期较正常对照组无明显变化;发病高峰期hif-1α表达较正常对照组明显增高(p<0.01)。发病高峰期hif-1α表达较发病初期增高(p<0.05)。发病高峰期hif-1α表达较发病缓解期增高。发病缓解期较正常对照组无明显变化。qpcr结果显示发病高峰期hif-1αmrna转录较正常对照升高(p<0.01)。发病高峰期hif-1αmrna转录较发病初期增高。发病高峰期与发病缓解期相比,hif-1αmrna转录增高。发病缓解期较正常对照组hif-1αmrna转录增高(p<0.05)。3glut1在疾病发病过程中的变化:pcr结果显示发病初期、发病高峰期、发病缓解期较正常对照组glut1mrna转录水平增高(发病初期、发病高峰期p<0.01,发病缓解期p<0.05)。发病高峰期与发病初期相比,glut1mrna转录增高(p<0.01)。发病高峰期与发病缓解期相比,glut1mrna转录增高(p<0.01)。发病初期较发病缓解期glut1mrna转录增高(p<0.05)。4pkm2在疾病发病过程中的变化:qpcr结果显示发病高峰期pkm2mrna转录较正常对照、发病初期、缓解期相比升高(p<0.01)。发病初期、缓解期较正常对照组相比无明显变化。5rorγt在疾病发病过程中的变化:qpcr结果显示发病初期、发病高峰期、发病缓解期较正常对照组rorγtmrna转录水平增高(p<0.01)。发病高峰期较发病初期,缓解期相比,rorγtmrna转录水平增高(p<0.01)。缓解期较发病初期比,rorγtmrna转录水平增高(p<0.05)。6il-17在疾病发病过程中的变化:qpcr结果显示发病高峰期、发病缓解期较正常对照组il-17mrna转录增高(p<0.01)。发病高峰期、发病缓解期较发病初期相比,il-17mrna转录增高(p<0.01)。高峰期较缓解期比,il-17mrna转录增高(p<0.01)。7ampkα在疾病发病过程中活化程度的变化:westernblot结果显示发病初期、发病高峰期较正常对照组无明显变化;发病高峰期较发病初期ampkα蛋白磷酸化程度增高(p<0.05)。发病缓解期较正常对照组、发病初期、发病高峰期相比,ampkα蛋白磷酸化程度明显增高(p<0.01)。8foxp3在疾病发病过程中的变化:qpcr结果显示发病初期、高峰期较正常对照组foxp3mrna转录无明显变化。发病缓解期较发病初期、发病高峰期相比,foxp3mrna转录增高(p<0.01)。发病缓解期较正常对照组相比,foxp3mrna转录无明显变化。第三部分二甲双胍通过激活ampk抑制mtor/hif-1α通路发挥对实验性自身免疫性脑脊髓炎的保护作用目的:建立c57bl/6小鼠eae模型,给予二甲双胍干预,观察eae模型组和met治疗组小鼠脾组织中ampk激活水平的变化及其对下游mtor活性抑制的变化情况。并对mtor/hif-1α通路参与细胞代谢的hif-1α、glut1、pkm2在两组中的表达差异进行比较。方法:1采用近交系雌性c57bl/6小鼠作为实验动物,周龄8-10周,体重为18-20g。应用mog35-55作为抗原,与完全弗氏佐剂和结核菌素混合后给予小鼠背部皮下注射,并于免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(ptx),建立eae动物模型。2将雌性c57bl/6小鼠随机分为正常对照组、eae模型组和met治疗组。自免疫后第1天(免疫当日记作第0天)开始,met治疗组小鼠给予每日腹腔注射met100mg/kg,正常对照组及eae模型组小鼠每日腹腔注射等量的生理盐水。自免疫日开始,每日给予小鼠两次神经功能评分,并测量体重,神经功能评分采用knoz评分法。3在疾病高峰期对各组小鼠脾组织取材,应用westernblot方法检测脾组织中ampk、pampk、s6k1、ps6k1、hif-1α、il-17蛋白表达情况,应用qpcr检测方法检测脾组织中hif-1α、glut1、pkm2mrna转录水平。4采用spss16.0统计软件进行统计分析。实验数据以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。多组计量资料均数的比较:方差齐时应用one-way-anova中snk-q检验进行方差分析,方差不齐时应用非参数秩和检验。以p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1westernblot方法检测脾组织中pampkα/ampkα:eae模型组较正常对照组pampkα/ampkα比较无明显差异。met治疗组较正常对照组、eae模型组pampkα/ampkα表达增加(p<0.01)。2westernblot方法检测脾组织中ps6k1/s6k1:eae模型组较正常对照组比较ps6k1/s6k1升高(p<0.01)。met治疗组较eae模型组比较ps6k1/s6k1减低(p<0.05)。met治疗组较正常对照组比较ps6k1/s6k1无明显变化。3westernblot、qpcr检测脾组织中hif-1α蛋白表达水平及mrna转录:westernblot结果显示eae模型组较正常对照组比较hif-1α蛋白表达升高(p<0.01)。met治疗组较eae模型组比较hif-1α蛋白表达减低(p<0.01)。met治疗组较正常对照组比较hif-1α蛋白表达无明显变化。qPCR结果显示EAE模型组较正常对照组比较HIF-1αmRNA转录水平升高(P<0.01)。MET治疗组较EAE模型组比较HIF-1αmRNA转录水平减低(P<0.01)。MET治疗组较正常对照组比较HIF-1αmRNA转录水平升高(P<0.01)。4 Western Blot、qPCR方法检测脾组织中IL-17蛋白表达水平及mRNA转录:Western Blot结果显示EAE模型组较正常对照组比较IL-17蛋白表达升高(P<0.01)。MET治疗组较EAE模型组比较IL-17α蛋白表达减低(P<0.05)。MET治疗组较正常对照组比较IL-17蛋白表达无明显变化。qPCR结果显示EAE模型组较正常对照组比较IL-17mRNA转录水平升高(P<0.01)。MET治疗组较EAE模型组比较IL-17mRNA转录水平减低(P<0.01)。MET治疗组较正常对照组比较IL-17mRNA转录水平升高(P<0.01)。5 qPCR方法检测脾组织中Glut1mRNA转录:EAE模型组较正常对照组比较Glut1mRNA转录水平升高(P<0.01)。MET治疗组较EAE模型组比较Glut1mRNA转录水平减低(P<0.01)。MET治疗组较正常对照组比较Glut1转录水平减低(P<0.05)。6 qPCR方法检测脾组织中PKM2 mRNA转录:EAE模型组较正常对照组比较PKM2mRNA转录水平升高(P<0.01)。MET治疗组较EAE模型组比较PKM2mRNA转录水平减低(P<0.01)。MET治疗组较正常对照组比较PKM2mRNA转录水平减低(P<0.01)。结论:1应用MOG35-55免疫C57BL/6雌性小鼠成功建立EAE模型,给予MET干预可以降低动物发病率并减轻了EAE发病的临床症状,抑制了炎症细胞向中枢神经系统的浸润。2应用MET干预,通过调节Th17/Treg细胞比例,调节Th17细胞和Treg细胞的特征性炎症因子和转录因子在外周免疫器官和中枢神经系统的表达而达到对EAE的保护作用。3参与细胞代谢的HIF-1α、Glut1、PKM2、AMPK在疾病中的变化规律与疾病发生发展、Th17细胞和Treg细胞在疾病中的变化有关。应用MET干预,通过调节AMPK/mTOR/HIF-1α信号通路发挥对EAE的保护作用。