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目的通过四种体外杀伤检测方法的方法学优化及分析比较,找到一种可以替代经典的51Cr释放法的、相对快速的、并可用于多种具有杀伤活性的免疫细胞的体外杀伤效力评价的方法。同时开展了NK细胞体外杀伤效力的替代指标的探索研究,以期获得与体外杀伤效力相关的、可用于产品快速放行的替代指标,提高产品放行的安全性。方法以自然杀伤性NK细胞系NK-92为效力细胞,以K562细胞为靶细胞,分别对四种体外杀伤检测方法BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法的标记条件、杀伤时间、效靶比等参数进行优化,分析每种方法的实验内及实验间可重复性、与51Cr释放法相关性,并分析用于不同靶细胞及不同效应细胞的广谱性。NK-92细胞在与靶细胞杀伤过程中,分别取作用不同时间点的样本,采用流式细胞术分别检测了靶细胞在杀伤过程中的凋亡变化,及CD107a及CD69表面分子表达的时效性;通过Luminex检测了IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B三种细胞因子的分泌;同时,在不同杀伤时间点将NK-92细胞分选出来,并通过高通量测序,分别进行转录组表达差异分析及小RNA变化分析,并通过GO富集、KEGG富集筛选出与杀伤相关的差异表达基因及其相关小RNA,并通过荧光定量PCR进行验证,为进一步寻找与杀伤效力相关的替代分子标志提供基础。结果经方法学优化后,四种体外杀伤方法在一定范围内均可显示出杀伤效力与效靶比的相关性,但与其它三种方法相比,CytoTox-Glo法在高效靶比时（40:1）表现出明显的倒钩效应;四种方法中,BATDA法的检测时间最短,NK-92细胞与K562细胞作用1个小时即可检测出明显的杀伤效力,CAM法及PHK法基本上都需要作用4个小时才能测出明显的杀伤,而CytoTox-Glo法可能需要6-8个小时才能看出明显的杀伤结果;四种方法的实验内与实验间可重复性均相对较好,其中BATDA法及CAM法表现出更好的可重复性;四种方法与51Cr释放法均具有一定的相关性,但BATDA法与51Cr释放法曲线的拟合度更好,R2=0.9281;与其它三种方法相比,BATDA法可用于贴壁性的卵巢癌细胞Caov3及其它效应细胞如自体NK细胞和CAR T细胞的杀伤效力检测,并显示出个体差异性。NK-92细胞与K562细胞以效靶比为10:1混合后,每隔15分钟取样检测至2小时结束,结果显示,靶细胞的凋亡呈直线增加,且与无靶细胞对照组相比,实验组效应细胞IFN-γ的分泌量从75分钟开始增长,随着杀伤时间的延长呈指数形式增加,且与杀伤高度相关,R2=0.9366;颗粒酶B和穿孔素均在75min时浓度明显增加,其他时间与对照无明显差异。CD69在NK-92细胞系表面持续高表达,而CD107a有略微表达增加但与杀伤无明显相关性。分别对不同效靶作用时间中效应细胞NK-92的转录组及小RNA进行分析,结果显示,多于135个基因、多于61个小RNA显示有差异表达,根据GO和KEGG富集分别选择了BIRC3、CSF2、VCAM1三个与杀伤相关的差异表达基因及其相关小RNA hsa-miR-24-2-5p和hsa-miR-624-5p、hsa-mi R-532-3p、hsa-miR-545-3p,采用qPCR法进一步验证,结果显示在杀伤过程中三个基因差异表达具有显著性,p<0.05,而小RNA的差异表达不具有显著性。结论BATDA法的检测结果与51Cr释放法的线性相关性最好,作用时间短、方法的可重复性好,并且其在靶细胞及效应细胞的适用范围广,因此,BATDA法具有替代51Cr释放法用于NK及其它免疫细胞的体外杀伤效力评价的应用前景。IFN-γ以及BIRC3、CSF2、VCAM1三个与杀伤相关的差异表达基因有望成为杀伤效力快速评价的的替代指标或分子标志,但与效力间的量效关系尚需做深入的研究。