论文部分内容阅读
为实现在野生酵母菌株JSY4中组成型表达β-甘露聚糖酶，首先采用PCR方法从毕赤酵母GS115基因组DNA中扩增出500bp的三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(P<,GAP>)，以其取代分泌型表达载体pPIC9K的诱导型启动子(P<,AOX1>)片断，构建了组成型载体pGAP；再从野生型酵母JSY4基因组DNA中扩增出1700bp的25S rDNA保守序列，以其取代pGAP载体上的HIS4片断，构建了整合组成型载体pGAP-rDNA；然后将重组质粒pT002-Man Ⅰ中的Man Ⅰ片断插入pGAP-rDNA的多克隆位点，获得含有目的基因Man Ⅰ的整合组成型表达载体pGAP-rDNA-Man Ⅰ。pGAP-rDNA-ManⅠ经NcoⅠ线性化后用电击法转化野生酵母菌株JSY4，通过G418抗性筛选和PCR鉴定得到阳性整合子JSY4(pGAP-rDNA-Man Ⅰ)，对阳性菌株培养上清液进行ELISA双抗夹心法和DNS法测定酶活，表明有β-甘露聚糖酶活性。因此，整合组成型表达载体pGAP-rDNA-Man Ⅰ已被构建成功，Man Ⅰ基因也已经整合到JSY4酵母染色体中，并进行了中组成型表达。