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野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种维管束致病菌,它能够侵染多种十字花科植物并导致黑腐病(black rot disease)。该病原菌已经被作为细菌与植物相互作用的重要模式菌之一被广泛研究。我们利用Tn5随机插入以及定点基因敲除的方法得到大量的Xcc突变体,通过致病性筛选确定了一批与Xcc致病相关的基因。本研究课题通过对几个有代表性的致病基因的研究与分析进一步揭示和阐明了Xcc与寄主相互作用的分子机理。
III型分泌系统是病原细菌致病所依赖的一个非常重要的系统,通过III型分泌系统,病原细菌将大批的效应因子(effector)分泌到寄主细胞内。这些效应因子在寄主细胞内具有一定的功能会引发寄主一系列的反应。如有些效应因子能够调节寄主细胞的生理生化反应,促进细菌的侵染;有些则会被寄主所识别,引发寄主抗性,进而阻碍细菌的侵染。本博士研究课题的部分内容是有关于Xcc III型分泌的两个效应因子AvrXccC和XcvA的功能研究。AvrXccC是一个具有双重功能的效应因子,它在大部分敏感寄主如甘蓝上起毒性作用促进细菌致病,但是在芥菜上却是起着无毒基因的作用,是细菌能够被寄主所识别的决定因子。分析发现在有些能够侵染芥菜并致病的Xcc菌株中并不存在avr XccC基因,但是如果将avr XccC转入到这些Xcc菌株中表达便会改变原本它们与芥菜发生的亲和反应,使它们像Xcc8004一样被芥菜寄主所识别。avr XccC基因在基因组中处于致病岛中,而且在不同的Xcc菌株中存在的位置也有所不同。avrXccC基因的表达是依赖于III型分泌调节因子HrpG和HrpX的,其分泌也是依赖于III型分泌结构基因的。AvrXccC的核心分泌信号位于前40个氨基酸,全部的分泌信号存在于前120氨基酸中。在寄主植物细胞中,AvrXccC是定位在细胞膜上的,并且这个细胞膜上的定位对于其能够被寄主识别是必需的。
XcvA是一个半胱氨酸蛋白酶,在其C-末端具有一个保守的蛋白酶催化结构域(peptidase C48)。Small ubiquitin-like modifier(SUMO)能够对许多蛋白进行翻译后修饰,参与到许多的细胞进程的调节。XcvA在寄主植物细胞内能够模拟SUMO蛋白酶将SUMO从其共价结合的蛋白上切割下来。XcvA的突变会引起致病性的徽弱变化,而过量表达XcvA则会在敏感寄主和非寄主上增强毒性,在非寄主上微弱的延迟HR。进一步的检测我们发现XcvA能够成功抑制拟南芥中由细菌鞭毛诱导产生的受体激酶FRK1的表达,同时作者对于它作为III型分泌效应因子的一些特性也进行了细致的分析。
另一个对于Xcc致病具有重要作用的是II型分泌系统,其中起主要作用的是胞外酶。这些胞外酶主要参与到对于寄主细胞细胞壁结构的切割与分解,为细菌侵染提供营养及去除物理障碍。我们所研究的两个多聚半乳糖醛酸酶主要是在细菌对于寄主侵染过程的初期中起重要作用。他们虽然属于II型分泌系统,且依赖于II型分泌系统的结构基因才能分泌,但是它们的表达是受到了III型分泌系统HrpG和HrpX的调控的。作者分析了其在植物细胞中受高效诱导的表达情况,同时对于它们的胞外酶活性及生长情况进行了检测。
本课题所涉及到的最后一个研究内容是一种多肽末端特异识别型蛋白酶Plp(Prc like protease),它与细菌致病相关联主要参与到细菌的翻译后修饰过程中。这种多肽末端特异型蛋白酶与大肠杆菌中一种重要的多肽末端特异识别型蛋白酶Tsp(Prc)是同源的。对于plp基因的突变能够引起Xcc在敏感寄主上毒性作用的降低,而且能够使Xcc对于热和渗透压变得比较敏感。plp的突变体比野生型生产EPS能力会降低,并且会对一些抗生素变得比较敏感,plp编码一个定位于细菌细胞周质空间的一个多肽末端特异性识别蛋白酶,其突变能够降低Xcc胞外蛋白酶的活力。