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瘙痒(pruritus)被定义为"一种能引起搔抓行为的不愉快的皮肤感觉"，是一系列皮肤疾病的主要症状。缓激肽B1受体(bradykinin B1 receptor, B1R)兴奋剂可在完全佛氏佐剂(Complete Freunds adjuvant，CFA)所致的炎性皮损区内引起明显的瘙痒反应，并且这种瘙痒反应可被B1R拮抗剂所抑制，说明CFA导致的炎症模型获得了新的瘙痒敏化特征，促使原本对B1R兴奋剂无反应的状态向产生瘙痒反应转化，具体机制仍不明。 胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK(Mitogen-activated protein kinase)家族的一员。CFA外周足底注射能引起冷、热、机械痛觉过敏，同时引起脊髓ERK1/2的持续活化上调，并且能被磷酸化ERK1/2(Phosphorylated extracellular signal-regulatedkinase1/2，pERK1/2)抑制剂所拮抗，提示脊髓ERK1/2在CFA引起的外周慢性炎症中活化并参与了这种炎性痛的发生发展。 我们的前期研究也发现，致痛剂缓激肽和B1R激动剂(Bradykinin1 receptoragonist，B1RA)都能在CFA慢性炎症模型中引起瘙痒反应，并且都能被全身应用B1R拮抗剂抑制，这两种瘙痒反应都是一种异常的瘙痒感受，是在慢性炎症基础上发生的，结合B1R具有诱导表达增加的特性，我们在本研究中对B1R在CFA慢性炎症模型中的表达是否上调做进一步的研究。 第一章 ERK1/2在缓激肽B1受体激活引起炎性皮损区瘙痒反应中的作用研究 目的: 缓激肽B1受体兴奋剂在CFA炎性皮损区能引起搔痒行为，这是一种在炎症条件下产生的异常的瘙痒反应，可能由于炎症条件下导致了瘙痒通路的敏化。慢性瘙痒传导中的许多非瘙痒神经元可以转变成瘙痒神经元，包括通常用于传递疼痛信号的神经元，或者通过疼痛神经元增强瘙痒的感觉。ERK通路在疼痛和瘙痒传导中都具有重要作用，因而有必要探讨ERK通路是否在传导这种异常的瘙痒反应中也发挥作用。 材料与方法: 1.实验动物 本研究选用体重20-25 g的雄性C57BL/6J小鼠，无特定病原体(speceficpathogen free，SPF)，级，购自中山大学实验动物中心。实验动物的使用及处理方法均符合广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求，每只动物只使用一次，并尽可能减少动物的使用数量。 2.抑制ERK1/2通路对激活B1R引起炎性皮损区瘙痒反应的作用 动物模型的制备与前期实验相同。小鼠颈背部注射CFA(50ul)96 h后，于实验前放于透明塑料盒内适应30 min，七氟醚麻醉下用胰岛素注射器（30 G针头）分别腹腔注射ERK1/2和pERK1/2抑制剂(10mg/kg和25mg/kg，100μL，对照组腹腔注射溶剂10％二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，腹腔注射后立即放入塑料盒内。30min后再于七氟醚麻醉下用胰岛素注射针（30 G针头）颈背部炎性皮损区皮内注射B1R激动剂，放入塑料盒内观察小鼠用后肢搔抓药物注射部位的次数，每只小鼠观察30 min。 3.pERK1/2在CFA炎症模型小鼠中的表达 小鼠颈背部CFA致炎96 h后，七氟醚麻醉后断颈处死，取颈段相应背根节神经元及脊髓，经western blot的蛋白裂解、凝胶制备、膜转移、电化学发光(electrochemiluminescence， ECL)显影等步骤及免疫组化染色（Immunohistochemistry，IHC）的切片、抗原修复、孵育等步骤检测pERK1/2在CFA炎症模型小鼠背根节神经元和脊髓中的表达情况。 4.B1受体激动剂对CFA炎症模型小鼠pERK1/2表达情况的影响 96h后的模型小鼠颈背部炎性皮损区皮下注射B1R兴奋剂（0.4Mm/5oul，对照组生理盐水），5、15、30、45、60min后七氟醚麻醉下断颈处死，取相应节段的脊髓和背根节神经元，用同前的western blot观察pERK1/2在CFA模型小鼠皮损区注射B1受体兴奋剂后的表达变化情况。 5.TRPA1和ET-A/ECE-1拮抗剂对B1R引起炎性皮损区瘙痒反应的作用 小鼠颈背部注射CFA，第4天七氟醚麻醉下用胰岛素注射器（30 G针头）分别腹腔注射TRPA1和内皮素1转化酶（endothelin-converting enzyme1，ECE-1）拮抗剂（4mg/kg和25mg/kg，100μL，对照组注射2％DMSO和10％DMSO），腹腔注射后立即放入塑料盒内。30min后再于七氟醚麻醉下用胰岛素注射针(30 G针头)颈背部炎性皮损区皮内注射B1R兴奋剂，放入塑料盒内观察小鼠用后肢搔抓药物注射部位的次数，每只小鼠观察30 min;对另一组小鼠于实验前放于透明塑料盒内适应30 min，七氟醚麻醉下用胰岛素注射器（30 G针头）在炎性皮损区皮肤内皮下注射内皮素1受体(Endotholin A，ETA)拮抗剂和B1R激动剂的混合液（1mM和0.4mM，50μL，对照组注射生理盐水Normal salin,NS），放入塑料盒内观察小鼠用后肢搔抓药物注射部位的次数，观察30 min。 6.统计学方法 本研究各组数据均采用均数±标准差（(x)±s）表示，运用SPSS16.0版统计软件包进行分析。两组间数据采用两独立样本t检验（正态分布并且方差齐时）或者近似法t检验（方差不齐时）;皮下注射B1R激动剂后不同时间点pERK1/2表达的western blot结果数据的比较采用重复测量数据的方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。 结果: 1.抑制ERK1/2通路明显减少B1R引起炎性皮损区的瘙痒行为。 2.pERK1/2在CFA炎症模型小鼠脊髓中的表达明显增加。 3.B1受体激动剂使CFA炎症模型小鼠pERK1/2在脊髓内的表达明显增加。 4.TRPA1和ET-A/ECE-1通路没有介导B1R引起炎性皮损区瘙痒反应的作用。 第二章 缓激肽B1受体在CFA炎症模型小鼠的表达 目的: 与缓激肽B2受体的组成性表达不同，B1受体在正常皮肤中表达很少，但能在组织损伤和炎症反应中诱导表达。我们的前期研究发现，B1受体参与介导CFA炎性皮损区的触诱痒和致痛物缓激肽引起的瘙痒，因而有必要进一步探讨CFA炎症模型小鼠B1R的表达情况。 材料与方法: 1.实验动物 本研究选用体重20-25 g的雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，购自中山大学实验动物中心。实验动物的使用及处理方法均符合广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求，并尽可能减少动物的使用数量。 2.B1R在CFA炎症模型小鼠中的表达情况 小鼠颈背部CFA致炎96 h后，于七氟醚麻醉后取颈背部炎性皮损区（或者生理盐水对照组）全层皮肤、相应脊髓和背根节神经元经western blot的蛋白裂解、凝胶制备、膜转移、ECL显影等步骤检测B1R蛋白的表达;并经RT-PCR的RNA提取、逆转录等从基因水平进一步检测B1的表达。 3.B1R激动剂对CFA炎症模型小鼠B1R表达情况的影响 模型小鼠颈背部炎性皮损区皮下注射B1R激动剂（0.4Mm/5oul，对照组生理盐水），30min后七氟醚麻醉下断颈处死，取相应脊髓和背根节神经元，用与前面一样的western blot方法检测B1R的表达变化情况。 4.统计学方法 本研究各组数据均采用均数±标准差（(x)±s）表示，运用SPSS16.0版统计软件包进行分析。两组间数据采用独立样本t检验（正态分布并且方差齐时）或者近似法t检验（方差不齐时）。P＜0.05为差异具有统计学意义。 结果: 1.B1R在CFA炎性模型小鼠皮肤和背根节神经元内的表达明显增加。 2.B1R激动剂使CFA炎性小鼠B1R在脊髓和背根节神经元内的表达明显增加。 全文结论: 1.pERK1/2在CFA炎症模型小鼠相应脊髓内的表达明显增加，但背根节神经元内的表达没有变化;并且皮下注射B1R激动剂能使pERK1/2在脊髓内的表达在30分钟时进一步上调，45分钟达峰值。 2.行为学上证实，抑制ERK1/2通路能明显减少B1R引起炎性皮损区的瘙痒行为。 3.缓激肽B1受体在CFA炎性模型皮损区皮肤和背根节神经元内的表达明显增加，但脊髓内的表达没有变化;皮下注射B1R激动剂30分钟后能使B1R在脊髓和相应背根节神经元内表达明显增加。