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蚬壳花椒(Zanthoxylum dissitum Hemsl)又名单面针,是我国南方重要的珍稀林药资源。其根、茎、叶均可入药,临床上有祛风活络、散瘀止痛、解毒消肿之功效。蚬壳花椒中富含白藓碱、茵芋碱、熊果酸及黄酮甙类等多种珍贵药用成份,具有显著的抗病原真菌活性和良好的治疗高血脂、糖尿病、心血管疾病及癌症效果。与蚬壳花椒重要的经济价值、社会价值和科学研究价值相比,蚬壳花椒的分子生物学研究相对滞后,制约着蚬壳花椒的培育,以及关键基因资源的挖掘。本研究以产自湖南张家界地区的蚬壳花椒种子为实验材料,将GID1与PP2C这两类萌发关键基因为研究对象,通过人工促萌发过程研究蚬壳花椒GID1表达量变化与萌发进程的关系。通过内源激素的分析,结合转录组学找寻蚬壳花椒萌发相关的PP2C磷酸酶,揭示萌发过程中PP2C表达量变化与内源激素ABA之间的关联。 主要研究结果如下: (1)取样的点的设置可以发现种子萌发过程中显著的胚形态学动态变化。蚬壳花椒种子萌发培养过程中:从第6h开始种子开始吸胀增大胚开始发育,12h胚与胚乳间形成间隔,这时种子吸水量也会迅速增加,胚开始生长,种子内贮存的营养物质开始大量消耗,此为种子细胞分裂和增大阶段,96h时胚生长后体积增大,突破种皮而外露,胚根初步形成种子萌发。 (2)内源激素的测定设定了4组对照组;WY:清水有壳浸泡培养、WU清水无壳浸泡培养、GY∶GA浸泡有壳浸泡处理、GU∶ GA无壳浸泡培养,为后续ZaPP2C表达量变化做关联研究做出铺垫。后壳除机械阻碍种子萌发外,还含有大量ABA,这也可能是蚬壳花椒种子难以萌发的关键因素之一,而外源GA的加入可增加种子中的GA含量,起到GA效应促进种子萌发,但关键影响蚬壳花椒种子难以萌发的原因可能还是由于种壳中内源ABA的含量较多造成的。 (3)从蚬壳花椒中克隆了了3个同源赤霉素受体基因ZaGID1a、ZaGID1b、ZaGID1c它们都具有已被验证的GID1的基因特征。人工萌发过程中ZaGID1a、ZaGID1c可能起着主要的调控作用,且在萌发前期表达量升高,萌发后期表达量降低,并且通过GA3对种子的快速调控机理从而达到提高种子萌发率同时缩短萌发周期。GID1同源基因对植物种子萌发起到关键调控作用,获得蚬壳花椒的GID1同源基因对以后解决蚬壳花椒自然资源匮乏至关重要。 (4)通过高通量转录组数据筛选得到2个ZaPP2C同源基因,通过生物信息学初步推测所克隆的ZaPP2C同源基因与种子萌发功能调节密切相关,克隆所得2个同源基因长度分别为1789bp、1705bp分别命名为ZaPP2C1、ZaPP2C2。将目的基因构建原核表达载体,得到ZaPP2C1为66.8kD,ZaPP2C2为66.2kD大小目的蛋白,对重组蛋白进行酶活测定,具有磷酸酶生物学活性与特性。2个同源基因的表达量都会受种子内源激素的调控,ZaPP2C2受外源GA的影响较大成正相关性,两者与内源ABA含量成负相关性,随着种子趋于萌发两者表达量都是先上升后下降,这可能是由于前期ZaPP2C参与了种内ABA信号传导通路,介导ABA受体响应ABA反应机制解除其抑制萌发作用,因而当内源激素ABA显著下降时,ZaPP2C有显著性表达趋势,后随着萌发进程的结束基因表达量下降,植物成完整幼苗时,可能由会伴随其他功能的ZaPP2C同源基因的表达来辅助幼苗的生长生理生化过程,因而逐步降低萌发相关功能调节的PP2C磷酸酶的表达。