猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

• 作 者: 林彦星
• 机 构: 华南农业大学
• 出 处: 华南农业大学
• 发表日期: 2006年期
• 关键词: 猪圆环病毒Ⅱ型 ORF2 原核表达 ELISA 免疫

本研究以传染病实验室分离的猪圆环病毒II型(Porcinecircovirustype2，PCV2)zs株作为研究对象，参照GenBank中已发表的ORF2基因序列，设计合成一对引物，利用PCR方法扩增了衣壳蛋白基因羧基端，大小为573bp，覆盖ORF2基因上的主要抗原位点。将PCR产物纯化后克隆到pMD18-TSimpleVector中，酶切鉴定后进行序列测定，应用DNASTAR分析软件与GenBank上己发表的其它毒株序列进行核苷酸及其推导氨基酸同源性比较，结果表明本毒株的ORF2截短基因与其它参考毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于98．4％～99．5％之间。
将重组质粒pMD-ORF2的EeoRV和Xho1I双酶切产物亚克隆到原核表达载体pET一32a(+)，构建ORF2基因重组表达质粒pET-ORF2。鉴定分析证实重组质粒pET-ORF的正确性后，将其转化至BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导表达，通过SDS-PAGE和WesternBlottlng分析，结果表明pET-ORF2在BL21(DE3)中成功表达，所表达的融合蛋白分子量为40kDa左右，与预期大小相符，并能被PCV2阳性血清识别，具有良好的抗原性。同时对该基因片段在不同诱导条件下的表达情况进行了分析比较，结果表明最佳IPTG诱导浓度为1．0mmol几，最佳诱导时间为5h。
将诱导后的菌体进行超声破碎，SDS-PAGE检测表明该融合蛋白主要以包涵体形式存在。大量诱导表达重组融合蛋白，利用HisBind蛋白质纯化试剂盒进行纯化，以纯化后的重组融合蛋白作为诊断抗原，通过对抗原抗体最适反应浓度、抗原最佳包被条件、封闭液和血清稀释液的选择、血清及酶标二抗的作用时间、底物及终止液的选择、以及特异性试验和重复性试验等条件的摸索，初步建立了一套检测PCV2抗体的间接ELISA方法。用该法对广东、广西一些地区收集到的380份血清样品进行检测，检测结果阳性率为86．1％，从中随机取∞份猪血清样品与国产商品化试剂盒检测结果对照相比，符合率为95．56％，且本ELISA方法检出的阳性率比试剂盒检出的阳性率高4．45％，表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性，为ELISA试剂盒标准化和商品化奠定了基础。
大量提取、纯化质粒pcDNA3．1-ORF2、PC-IL6，与纯化后的重组融合蛋白(z~Cap)分别免疫6w龄的BALB／c小鼠，以比较PCV2~单位疫苗和基因疫苗的免疫效果，同时设pcDNA3．1(+)、PC-IL6、PBS对照组。第一次免疫后的lOd和24d分别进行二免和三免。二免后10天和三免后7天断尾采血，分离血清用于检测血清中的抗体。三免后7d每组扑杀5只BALB／c小鼠，制备脾淋巴细胞，用MTT法测定其淋巴细胞转化率。结果表明，免疫组均能诱导BALB／c小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应，相比之下，亚单位疫苗免疫组的免疫效果优于基因疫苗免疫组。
本研究在大肠杆菌表达系统中表达了包含PCV2ORF2基因主要抗原表位的重组融合蛋白，将表达的重组蛋白纯化后作为检测抗原，初步建立了一套敏感、特异的ELISA检测PCV2抗体的方法，具有良好的应用前景。表达的融合蛋白具有良好的免疫原性，免疫效果优于基因疫苗，为进一步研制PCV2基因工程疫苗奠定了良好的基础。