论文部分内容阅读
木质素是一种由苯丙烷结构通过醚键和碳碳单键等连接而成的无定形天然高分子聚合物,是自然界中最为丰富的可再生芳香化合物资源。木质素的降解、转化和利用涉及到制浆造纸工业的清洁化生产、秸秆资源的利用以及环境污染的生物修复等多个领域。木质素的结构复杂,相对分子量高和难溶于水等特点使其很难被降解,极大限制了其应用。与化学和物理方法相比,生物解聚木质素,将其转化为高附加值平台化合物具有成本低廉、二次污染小等优势,因此受到越来越多的关注。而细菌及其分泌的酶具有易于基因操纵和蛋白表达的特性,并且细菌具有丰富的生物多样性和良好的环境适应能力等优势,因此木质素降解细菌及其降解酶的研究成为目前国际热点问题之一。近年来越来越多的研究表明,细菌来源的漆酶(Laccase)和染料脱色过氧化物酶(DyPs)在木质素生物降解中起着至关重要的作用。然而,这两种酶对木质素的解聚反应机制仍未完全阐明,制约了其在木质素解聚中的应用。因此,阐明细菌型漆酶和DyPs对木质素的生物催化机制将会为生物降解木质素实现工业化生产提供重要的理论基础。本论文将来自木质素降解细菌的木质素芽孢杆菌Bacillus ligninesis L1中的漆酶(Lacc)基因和丛毛单胞菌Comamonas serinivorans C35中的染料脱色过氧化物酶(DyP35)基因分别进行异源表达,研究了重组漆酶(Lacc)和重组染料脱色过氧化物酶(DyP35)的酶学性质以及对木质素的降解性能和作用机制,主要研究成果如下:(1)成功在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中分别高效异源表达Lacc和DyP35基因,获得E.coli BL21(Lacc)和E.coli BL21(DyP35)两株基因工程菌。表达产生的Lacc的分子量约为57 kDa,最大比活力为201.57±0.53 U/mg;表达产生的DyP35的分子量约为36 kDa,最大比活力为317.87±0.25 U/mg。(2)漆酶在细菌L1降解木质素中起着关键作用,敲除Lacc基因的突变细菌L1对木质素的降解能力显著降低。碱木质素的COD去除率从38.05%下降到15.43%,脱色率从33.05%下降到7.52%;磨木木质素的COD去除率从40.01%下降到16.39%,脱色率从30.04%下降到6.67%。(3)解析了Lacc和DyP35的酶学性质。Lacc的最适反应条件为pH 3.0,37℃,最适底物为ABTS,表现出高耐热性(20-70℃)和pH稳定性(2.0-5.0)。DyP35的最适反应条件为pH 4.0,30℃,对ABTS有较高的亲和力,具有很好的热稳定性(20-50℃)和pH稳定性(2.0-5.0)。(4)阐明了Lacc对木质素的解聚机制包括:(a)C-C偶联;(b)将羟基引入苯环;(c)甲氧基化反应形成甲氧基;(d)脱甲基脱羧;(e)还原;(f)交联键的断裂(例如4-O-5’、β-5’和5-5’)以及G、S和H-木质素单元的去除;(g)将木质素侧链的C_α上的羟基氧化并形成羰基;(h)脂肪族C-C键和木质素侧链的裂解。(5)阐明了DyP35对木质素的初步解聚机制是:(a)攻击苯环的侧链结构(例如β-O-4、C=O和C-C键);(b)脱除甲氧基并使木质素的羟基化程度增加;(c)去除G、S和H-木质素单元;(d)木质素被裂解成低分子的芳香族化合物,它们进一步被氧化修饰成结构简单的芳香有机酸,比如对羟基肉桂酸、阿魏酸、对羟基苯丙酸和香草酸等。综上所述,本研究全面阐明了细菌型Lacc降解木质素的反应机制,完整描述了Lacc氧化木质素的过程特征,并揭示了细菌型Lacc的催化机理;同时,该研究还明确了细菌型DyP35对木质素的初步解聚机制,为木质素生物炼制奠定了重要的理论基础。