【摘 要】
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大豆（Glycine max）是重要的油料作物,能够为人类和动物提供大量营养物质,但在其生长发育过程中经常遭受干旱、盐碱等胁迫。近年来,由于气候的恶劣变化,干旱日益严重,中国大豆的产量和品质遭到严重威胁。转录因子在植物抵御干旱方面起重要的作用。NAC转录因子家族是最大的植物特异转录因子家族之一,对植物抵御非生物胁迫具有重要作用。NAC转录因子N端为高度保守的NAC结构域,可与Ca MV 35S启动
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大豆（Glycine max）是重要的油料作物,能够为人类和动物提供大量营养物质,但在其生长发育过程中经常遭受干旱、盐碱等胁迫。近年来,由于气候的恶劣变化,干旱日益严重,中国大豆的产量和品质遭到严重威胁。转录因子在植物抵御干旱方面起重要的作用。NAC转录因子家族是最大的植物特异转录因子家族之一,对植物抵御非生物胁迫具有重要作用。NAC转录因子N端为高度保守的NAC结构域,可与Ca MV 35S启动子特异性结合,C端为转录调控区域,控制转录激活。多项研究表明,NAC转录因子在植物抵御逆境胁迫及生长发育过程中起重要作用。本研究从大豆抗旱品种吉林47中克隆得到大豆GmNAC4基因,并进行了生物信息学分析、生物学特征研究及表达模式分析,初步探究其功能,期望在了解GmNAC4基因功能的同时,也为植物抗逆分子育种提供候选基因。本研究的主要结果如下所示:1.从大豆根中提取RNA,反转录为c DNA,利用RT-PCR的技术从大豆中克隆获得GmNAC4基因。生物信息学分析表明,GmNAC4基因定位在20号染色体上,包括6个外显子,CDS序列为1650 bp,编码549个氨基酸;GmNAC4蛋白分子量为61.694 k Da,理论等电点为4.75;为亲水性蛋白,不存在信号肽;预测该蛋白定位于细胞核上。GmNAC4蛋白含有一个相对保守的NAM结构域,属于NAC转录因子家族。构建系统发育树,并进行同源比对分析。结果显示,与大豆相近的豆科植物氨基酸序列均具有NAM结构域,与野生大豆亲缘关系最近,为99.45%。2.构建p Bridge-GmNAC4酵母表达载体,转化酵母细胞,进行自激活实验,结果表明GmNAC4蛋白具有转录激活活性。构建瞬时表达载体p PSN-GmNAC4-GFP,并转化拟南芥叶片原生质体进行亚细胞定位实验。结果得出GmNAC4蛋白定位在细胞核上。生物学特征分析表明GmNAC4符合转录因子的基本特征。3.荧光定量PCR结果显示,GmNAC4主要表达部位是根。该基因对非生物胁迫和ABA均有响应。在200 m M Na Cl处理12 h时,GmNAC4的表达量有最大值,提高了8.6倍。在20%PEG6000处理下,GmNAC4基因表达总体呈上升趋势,在6 h达到最大值,约为对照的7.5倍;100μM ABA处理12 h时达到最大值,分别为对照的4.13倍;在PEG6000与ABA共同处理下,在6 h达到最大值,约为对照的9.68倍,表达量高于任何一种单独处理,说明GmNAC4基因可能通过ABA依赖途径介导植物耐旱。4.构建植物表达载体p CAMBIA3301-GmNAC4-GFP,利用K599农杆菌侵染大豆获得大豆发状根。干旱处理下,过表达大豆植株MDA含量显著降低,脯氨酸含量显著升高。表明转GmNAC4基因植株通过降低MDA的含量,增加渗透调节物质脯氨酸的积累,提高转基因植株的抗旱性。5.比较在含不同浓度PEG6000的MS固体培养基上拟南芥的发芽率及根长。在含PEG6000的培养基上,转基因拟南芥种子的发芽率显著升高,根也显著长。表明GmNAC4基因可以通过提高发芽率,增加根长,提高拟南芥耐旱性。
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