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试验研究了猪骨骼肌肌纤维分型方法、猪肌纤维特性的品种差异和组织特异性。以上市日龄地方品种蓝塘猪、大花白猪和外来品种长白猪半腱肌、斜方肌和腰大肌为试验材料,在组织学水平,采用六种方法进行肌纤维分型研究,即两类(Ⅰ和Ⅱ)、三类(βr、αr和αw)、四类肌纤维(Ⅰ、Ⅱx、Ⅱa和Ⅱb)分型ATPase、SDH联合酶组织化学酸法和碱法;采用酶组化法测定猪骨骼肌Ⅰ、Ⅱx、Ⅱa和Ⅱb型肌纤维特性的品种差异和组织特异性;采用Real-time RT-PCR法测定肌球蛋白重链MyHC-(Ⅰ、Ⅱx、Ⅱa和Ⅱb)mRNA表达丰度;采用原位RT-PCR和酶组化相结合的方法对猪腰大肌MyHC-Ⅰ mRNA分布情况进行了细胞定位。结果表明:
1.两类、三类、四类肌纤维分型酸法和碱法的分类结果除在猪骨骼肌肌纤维颜色存在差异外,在肌纤维组成方面无显著差异(P＞0.05);两类、三类、四类法在肌纤维数量比例和数量密度上存在不同程度的相关性:两类分型法中Ⅰ与四类法Ⅰ和Ⅱx之和差异不显著(P＞0.05),两类法中Ⅱ型肌纤维与四类法中Ⅱa和Ⅱb型之和差异不显著(P＞0.05);三类和四类肌纤维分型法中,βr与Ⅰ差异不显著(P＞0.05),αw的数量比例与Ⅱa和Ⅱb之和差异不显著(P＞0.05),βr和αr之和与Ⅰ和Ⅱx之和差异不显著(P＞0.05);比较六种方法的染色背景、试验操作难易程度以及对染色法条件的敏感度等方面发现,三类肌纤维分型酸法相对较为适宜。
2.在酸性预孵液pH 4.35和4.60、碱性预孵液pH 10.40左右条件下,都可能出现四类肌纤维分型。但最适pH值存在品种和部位差异。品种之间以腰大肌为例,大花白猪的最适预孵液pH值为4.35,而蓝塘猪和长白猪为4.30;部位之间以大花白猪为例,腰大肌最适pH值为4.35,半腱肌和斜方肌为4.40。预孵液预孵时间存在组织特异性。大花白猪腰大肌酸性预孵最适时间是5 min,而斜方肌和半腱肌的最适预孵时间为15 min,此外,相对适宜的SDH孵育时间为45min,ATP孵育时间为30min,pH值以9.40为宜。
3.品种和骨骼肌部位之间,猪骨骼肌肌肉的灰分、磷和胶原蛋白含量差异极显著(P＜0.01)。其中,长白猪肌肉的灰分和磷含量最低,胶原蛋白含量最高,且与蓝塘猪和大花白猪差异显著(P＜0.05);斜方肌的灰分和磷含量最低,且与腰大肌和半腱肌差异显著(P＜0.05)。不同品种猪的斜方肌和半腱肌胶原蛋白含量均显著高于腰大肌(P＜0.05),而蓝塘猪和长白猪的斜方肌又显著高于半腱肌(P＜0.05)。
4.猪骨骼肌MyHC-Ⅰ、Ⅱx、Ⅱa和Ⅱb mRNA相对表达丰度存在品种差异、组织特异性及其交互作用的差异。长白猪MyHC-Ⅰ mRNA表达丰度在斜方肌和半腱肌显著低于大花白和蓝塘猪(P＜0.05),蓝塘猪斜方肌MyHC-Ⅱa mRNA表达丰度显著高于大花白猪(P＜0.05);各品种猪斜方肌MyHC-Ⅰ mRNA表达丰度均显著高于半腱肌和腰大肌(.P＜0.05),而斜方肌MyHC-Ⅱx和MyHC-Ⅱb mRNA表达丰度显著低于半腱肌和腰大肌(P＜0.05)。此外,猪骨骼肌Ⅰ、Ⅱx、Ⅱa和Ⅱb型肌纤维组成上存在品种差异和组织特异性(P＜0.05)。
5.直接原位RT-PCR法所检测出的MyHC-Ⅰ mRNA主要在肌纤维细胞内表达,其中面积较小肌纤维内表达的阳性信号较强。与酶组化法鉴别出的四类肌纤维横截面积相比,发现MyHC-I mRNA表达阳性信号较强的肌纤维面积更接近于酶组化四类肌纤维分型法中所测得的Ⅰ型肌纤维面积(P＞0.05)。
本试验在组织学水平上建立了六种酶组织化学肌纤维分型方法,并将原位RT-PCR方法应用于肌纤维分型研究上。经试验证明,猪骨骼肌肌纤维特性存在品种差异和组织特异性。