论文部分内容阅读
研究目的
颈动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是导致缺血性卒中的重要病因，是一种慢性炎症性疾病。NLRP3炎症小体激活作为炎症反应的核心过程之一，可诱导IL-1β和IL-18的分泌，参与AS炎症反应；miR-155作为调控AS炎症信号通路的重要分子，可广泛作用于AS相关的多种细胞，调节炎症相关基因的表达；二者均为AS炎症机制中的重要调控环节，但目前关于miR-155是否可通过作用于NLRP3炎症小体调控AS炎症及其作用通路尚不明确。我们拟采用ApoE-/-小鼠建立颈AS动物模型研究miR-155对颈AS斑块形成和斑块内NLRP3炎症小体激活的影响；采用ox-LDL诱导的THP-1单核巨噬细胞建立AS炎症细胞模型，研究miR-155对ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的影响及作用机制，明确miR-155通过激活NLRP3炎症小体参与颈AS斑块形成的机制。
研究方法
第一部分miR-155对ApoE-/-小鼠颈AS斑块形成的影响
本研究采用ApoE-/-小鼠作为研究对象，通过颈动脉套管术和高脂饮食喂养建立颈AS动物模型，应用慢病毒转染干预小鼠体内miR-155表达，观察小鼠颈AS斑块形成情况，并检测血浆血脂水平和颈动脉NLRP3炎症小体相关蛋白表达。
1.建立颈AS小鼠模型及慢病毒转染：选取40只6周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠(体重16-22g)，给予高脂饮食(0.25%胆固醇+15%脂肪)喂养，于8周龄时采用右侧颈总动脉套管术诱导颈AS斑块形成。套管手术后48h通过尾静脉注射慢病毒(lentivirus，LV)载体干预体内miR-155表达。ApoE-/-小鼠随机分为如下四组：空白对照组(右颈动脉套管术+高脂饮食)、阴性对照组(右颈动脉套管术+高脂饮食+尾静脉注射LV-NC)、miR-155上调组(颈动脉套管术+高脂饮食+尾静脉注射慢病毒LV-miR-155)和miR-155下调组(颈动脉套管术+高脂饮食+尾静脉注射慢病毒LV-miR-155-RNAi)。
2.ApoE-/-小鼠处死及取材：ApoE-/-小鼠在16周龄时处死，取血样检测血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL)的水平；取约1cm长套管侧颈总动脉及健侧颈总动脉备用。
3.斑块形态学观察：套管侧颈总动脉固定后用于制作石蜡切片，行HE染色后观察每组动脉AS斑块形成情况及血管壁结构改变。
4.miR-155和NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平检测：提取动脉组织总RNA进行RT-PCR实验检测各组ApoE-/-小鼠颈动脉miR-155表达水平。套管侧颈总动脉石蜡切片经免疫组化(immunohistochemistry，IHC)染色后观察斑块内caspase-1和IL-1β表达情况；提取动脉组织总蛋白，应用免疫印迹杂交(Western blot)检测颈动脉NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平。
第二部分miR-155通过ERK/NF-κB通路调节ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活
采用ox-LDL诱导的单核巨噬细胞建立AS炎症细胞模型，应用miR-155-mimics和miR-155inhibitors干预细胞内miR-155表达；应用ERK通路抑制剂U0126阻断ERK通路。采用RT-PCR和Westernblot测定细胞内miR-155、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平以及ERK/NF-κB通路磷酸化水平。
1.泡沫细胞模型建立及细胞转染：THP-1单核细胞在完全培养基(1640培养基：胎牛血清：青链霉素=90:10:1)中培养，培养条件为37℃、5％CO2。悬浮的THP-1单核细胞给予100ng/ml佛波酯(PMA)孵育48h诱导其分化成巨噬细胞；随后应用100ug/ml的ox-LDL刺激24h促进泡沫细胞形成。应用Lipofectamine2000与miR-155-mimics、miR-155-inhibitor或其阴性对照混合以50nM的浓度转染巨噬细胞，培养在含100ug/mlox-LDL的新鲜完全培养基中，加入或不加入ERK通路抑制剂U0126(10uM)。。
2.油红O染色观察泡沫细胞形态：将细胞用PBS漂洗后在4％多聚甲醛溶液中固定；应用油红O工作液染色后漂洗，在显微镜下观察细胞内脂滴及细胞形态。
3.miR-155和NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平检测：提取细胞总RNA进行RT-PCR实验检测各组细胞内miR-155表达水平；提取细胞总蛋白，采用Westernblot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白和ERK/NF-κB通路的磷酸化水平。
结果：
第一部分miR-155对ApoE-/-小鼠颈AS斑块的影响
1.各组ApoE-/-小鼠miR-155表达水平：RT-PCR结果显示与阴性对照组相比(4.75±0.22)，LV-miR-155显著上调miR-155的表达至21倍左右(102.0±7.4)，LV-miR-155-RNAi下调miR-155的表达至38%(1.84±0.33)(P<0.0001)。
2.miR-155对高脂饮食ApoE-/-小鼠血浆血脂水平的影响：与阴性对照组相比，miR-155上调组的血浆TC和LDL-C水平明显增高(P<0.05)，TG水平有增高趋势(P>0.05)，HDL水平明显降低(P<0.05)。而miR-155下调组血浆TC、TG和LDL-C水平与阴性对照组相比均有降低趋势，HDL水平有升高趋势(P＞0.05)。
3.miR-155对ApoE-/-小鼠颈AS斑块形成的影响：HE染色显示空白对照组与阴性对照组颈动脉管壁增厚，管腔狭窄，可见内膜炎症细胞浸润，表明颈动脉套管术促进AS斑块形成。与阴性对照组相比，上调ApoE-/-小鼠体内miR-155水平后，套管侧颈动脉血管壁增厚更加明显，炎性细胞浸润，大量泡沫细胞形成，斑块体积增加，管腔严重狭窄；而miR-155下调组管壁轻度增厚，斑块形成和管腔狭窄明显减轻。
4.miR-155对ApoE-/-小鼠颈动脉中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平的影响：IHC结果显示miR-155上调组动脉AS斑块中caspase-1和IL-1β的表达水平明显高于其阴性对照组，miR-155下调组斑块中caspase-1和IL-1β的表达水平则降低，与HE染色中斑块的形成趋势一致。Westernblot结果显示，阴性对照组中NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1及IL-1β)的表达量明显低于miR-155上调组而高于miR-155下调组(P<0.05)。
第二部分miR-155通过ERK/NF-κB通路调节ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活
1.ox-LDL对单核巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的影响：油红O染色显示经过24hox-LDL(100μg/ml)刺激后，单核巨噬细胞内脂滴明显增多，提示泡沫细胞形成。检测细胞内NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18)表达水平发现，ox-LDL组NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；ox-LDL组细胞上清液中IL-1β和IL-18浓度也明显升高(P<0.05)。
2.ERK/NF-κB信号通路参与ox-LDL诱导的NLRP3炎症小体激活：我们检测ox-LDL刺激后的单核巨噬细胞内ERK/NF-κB通路磷酸化水平发现，与空白对照组相比，ox-LDL组细胞phosphor-ERK和phosphor-NF-κB蛋白水平明显升高(P<0.05)。在ox-LDL刺激的基础上进一步应用ERK通路阻断剂U0126后发现U0126可明显抑制ERK以及其下游NF-κB的磷酸化(P<0.05)。与单纯ox-LDL刺激组相比，ox-LDL+U0126组细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，与单纯U0126相比则没有差异。
3.miR-155对ox-LDL诱导的NLRP3炎症小体激活的影响：我们检测了ox-LDL诱导后的单核巨噬细胞中的miR-155表达发现，与空白对照组相比(1.15±0.24)，ox-LDL刺激后细胞内miR-155表达明显增加(2.11±0.93)(P<0.05)。我们在ox-LDL刺激的基础上干预细胞内miR-155表达，RT-PCR结果显示与mimics-NC组相比(1.63±0.69)，miR-155-mimics可明显上调miR-155表达至56倍(91.37±7.24)；与inhibitor-NC组相比(1.83±1.27)，miR-155-inhibitor转染后细胞miR-155下调至24%(0.44±0.08)(P<0.05)。随后我们检测细胞内NLRP3炎症小体相关分子表达发现，miR-155表达上调后细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表达明显增高(P<0.05)，培养液中的IL-1β和IL-18释放也明显增加(P<0.05)。miR-155inhibitor组与其阴性对照组相比，胞内caspase-1和IL-18蛋白表达以及细胞上清中的IL-1β和IL-18水平明显降低(P<0.05)，其他炎症小体相关分子表达有降低趋势(P>0.05)。
4.ERK/NF-κB通路参与miR-155诱导的NLRP3炎症小体激活：Westernblot检测结果显示，miR-155上调组细胞在NLRP3炎症小体过度激活的同时伴有ERK/NF-κB通路磷酸化水平明显增加；而miR-155下调组ERK/NF-κB通路磷酸化水平则显著下降(P<0.05)。我们进一步在上调miR-155基础上应用U0126发现miR-155mimics+U0126组和miRNAmimics+U0126组细胞内ERK/NF-κB通路磷酸化水平明显低于其阴性对照组(P<0.05)；且miR-155mimics+U01126组的磷酸化水平下降程度高于miRNAmimics+U0126组。miR-155mimics+U0126组和miRNAmimics+U0126组细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表达明显降低(P<0.05)，培养液中的IL-1β和IL-18水平也明显下降(P<0.05)，且miR-155mimics+U0126组的炎症小体相关分子表达水平降低程度高于miRNAmimics+U0126组，与ERK/NF-κB通路磷酸化水平检测结果一致。
结论：
1.颈AS小鼠模型中上调miR-155可促进NLRP3炎症小体的激活，加重AS病变；抑制miR-155表达则可抑制炎症小体激活，减轻AS。
2.ox-LDL可能通过ERK/NF-κB信号通路诱导单核巨噬细胞NLRP3炎症小体激活。
3.miR-155可通过ERK/NF-κB通路对ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活发挥调节作用。
4.miR-155可能通过ERK/NF-κB通路调控NLRP3炎性小体激活参与AS的发生发展。
颈动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是导致缺血性卒中的重要病因，是一种慢性炎症性疾病。NLRP3炎症小体激活作为炎症反应的核心过程之一，可诱导IL-1β和IL-18的分泌，参与AS炎症反应；miR-155作为调控AS炎症信号通路的重要分子，可广泛作用于AS相关的多种细胞，调节炎症相关基因的表达；二者均为AS炎症机制中的重要调控环节，但目前关于miR-155是否可通过作用于NLRP3炎症小体调控AS炎症及其作用通路尚不明确。我们拟采用ApoE-/-小鼠建立颈AS动物模型研究miR-155对颈AS斑块形成和斑块内NLRP3炎症小体激活的影响；采用ox-LDL诱导的THP-1单核巨噬细胞建立AS炎症细胞模型，研究miR-155对ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的影响及作用机制，明确miR-155通过激活NLRP3炎症小体参与颈AS斑块形成的机制。
研究方法
第一部分miR-155对ApoE-/-小鼠颈AS斑块形成的影响
本研究采用ApoE-/-小鼠作为研究对象，通过颈动脉套管术和高脂饮食喂养建立颈AS动物模型，应用慢病毒转染干预小鼠体内miR-155表达，观察小鼠颈AS斑块形成情况，并检测血浆血脂水平和颈动脉NLRP3炎症小体相关蛋白表达。
1.建立颈AS小鼠模型及慢病毒转染：选取40只6周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠(体重16-22g)，给予高脂饮食(0.25%胆固醇+15%脂肪)喂养，于8周龄时采用右侧颈总动脉套管术诱导颈AS斑块形成。套管手术后48h通过尾静脉注射慢病毒(lentivirus，LV)载体干预体内miR-155表达。ApoE-/-小鼠随机分为如下四组：空白对照组(右颈动脉套管术+高脂饮食)、阴性对照组(右颈动脉套管术+高脂饮食+尾静脉注射LV-NC)、miR-155上调组(颈动脉套管术+高脂饮食+尾静脉注射慢病毒LV-miR-155)和miR-155下调组(颈动脉套管术+高脂饮食+尾静脉注射慢病毒LV-miR-155-RNAi)。
2.ApoE-/-小鼠处死及取材：ApoE-/-小鼠在16周龄时处死，取血样检测血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL)的水平；取约1cm长套管侧颈总动脉及健侧颈总动脉备用。
3.斑块形态学观察：套管侧颈总动脉固定后用于制作石蜡切片，行HE染色后观察每组动脉AS斑块形成情况及血管壁结构改变。
4.miR-155和NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平检测：提取动脉组织总RNA进行RT-PCR实验检测各组ApoE-/-小鼠颈动脉miR-155表达水平。套管侧颈总动脉石蜡切片经免疫组化(immunohistochemistry，IHC)染色后观察斑块内caspase-1和IL-1β表达情况；提取动脉组织总蛋白，应用免疫印迹杂交(Western blot)检测颈动脉NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平。
第二部分miR-155通过ERK/NF-κB通路调节ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活
采用ox-LDL诱导的单核巨噬细胞建立AS炎症细胞模型，应用miR-155-mimics和miR-155inhibitors干预细胞内miR-155表达；应用ERK通路抑制剂U0126阻断ERK通路。采用RT-PCR和Westernblot测定细胞内miR-155、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平以及ERK/NF-κB通路磷酸化水平。
1.泡沫细胞模型建立及细胞转染：THP-1单核细胞在完全培养基(1640培养基：胎牛血清：青链霉素=90:10:1)中培养，培养条件为37℃、5％CO2。悬浮的THP-1单核细胞给予100ng/ml佛波酯(PMA)孵育48h诱导其分化成巨噬细胞；随后应用100ug/ml的ox-LDL刺激24h促进泡沫细胞形成。应用Lipofectamine2000与miR-155-mimics、miR-155-inhibitor或其阴性对照混合以50nM的浓度转染巨噬细胞，培养在含100ug/mlox-LDL的新鲜完全培养基中，加入或不加入ERK通路抑制剂U0126(10uM)。。
2.油红O染色观察泡沫细胞形态：将细胞用PBS漂洗后在4％多聚甲醛溶液中固定；应用油红O工作液染色后漂洗，在显微镜下观察细胞内脂滴及细胞形态。
3.miR-155和NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平检测：提取细胞总RNA进行RT-PCR实验检测各组细胞内miR-155表达水平；提取细胞总蛋白，采用Westernblot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白和ERK/NF-κB通路的磷酸化水平。
结果：
第一部分miR-155对ApoE-/-小鼠颈AS斑块的影响
1.各组ApoE-/-小鼠miR-155表达水平：RT-PCR结果显示与阴性对照组相比(4.75±0.22)，LV-miR-155显著上调miR-155的表达至21倍左右(102.0±7.4)，LV-miR-155-RNAi下调miR-155的表达至38%(1.84±0.33)(P<0.0001)。
2.miR-155对高脂饮食ApoE-/-小鼠血浆血脂水平的影响：与阴性对照组相比，miR-155上调组的血浆TC和LDL-C水平明显增高(P<0.05)，TG水平有增高趋势(P>0.05)，HDL水平明显降低(P<0.05)。而miR-155下调组血浆TC、TG和LDL-C水平与阴性对照组相比均有降低趋势，HDL水平有升高趋势(P＞0.05)。
3.miR-155对ApoE-/-小鼠颈AS斑块形成的影响：HE染色显示空白对照组与阴性对照组颈动脉管壁增厚，管腔狭窄，可见内膜炎症细胞浸润，表明颈动脉套管术促进AS斑块形成。与阴性对照组相比，上调ApoE-/-小鼠体内miR-155水平后，套管侧颈动脉血管壁增厚更加明显，炎性细胞浸润，大量泡沫细胞形成，斑块体积增加，管腔严重狭窄；而miR-155下调组管壁轻度增厚，斑块形成和管腔狭窄明显减轻。
4.miR-155对ApoE-/-小鼠颈动脉中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平的影响：IHC结果显示miR-155上调组动脉AS斑块中caspase-1和IL-1β的表达水平明显高于其阴性对照组，miR-155下调组斑块中caspase-1和IL-1β的表达水平则降低，与HE染色中斑块的形成趋势一致。Westernblot结果显示，阴性对照组中NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1及IL-1β)的表达量明显低于miR-155上调组而高于miR-155下调组(P<0.05)。
第二部分miR-155通过ERK/NF-κB通路调节ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活
1.ox-LDL对单核巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的影响：油红O染色显示经过24hox-LDL(100μg/ml)刺激后，单核巨噬细胞内脂滴明显增多，提示泡沫细胞形成。检测细胞内NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18)表达水平发现，ox-LDL组NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；ox-LDL组细胞上清液中IL-1β和IL-18浓度也明显升高(P<0.05)。
2.ERK/NF-κB信号通路参与ox-LDL诱导的NLRP3炎症小体激活：我们检测ox-LDL刺激后的单核巨噬细胞内ERK/NF-κB通路磷酸化水平发现，与空白对照组相比，ox-LDL组细胞phosphor-ERK和phosphor-NF-κB蛋白水平明显升高(P<0.05)。在ox-LDL刺激的基础上进一步应用ERK通路阻断剂U0126后发现U0126可明显抑制ERK以及其下游NF-κB的磷酸化(P<0.05)。与单纯ox-LDL刺激组相比，ox-LDL+U0126组细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，与单纯U0126相比则没有差异。
3.miR-155对ox-LDL诱导的NLRP3炎症小体激活的影响：我们检测了ox-LDL诱导后的单核巨噬细胞中的miR-155表达发现，与空白对照组相比(1.15±0.24)，ox-LDL刺激后细胞内miR-155表达明显增加(2.11±0.93)(P<0.05)。我们在ox-LDL刺激的基础上干预细胞内miR-155表达，RT-PCR结果显示与mimics-NC组相比(1.63±0.69)，miR-155-mimics可明显上调miR-155表达至56倍(91.37±7.24)；与inhibitor-NC组相比(1.83±1.27)，miR-155-inhibitor转染后细胞miR-155下调至24%(0.44±0.08)(P<0.05)。随后我们检测细胞内NLRP3炎症小体相关分子表达发现，miR-155表达上调后细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表达明显增高(P<0.05)，培养液中的IL-1β和IL-18释放也明显增加(P<0.05)。miR-155inhibitor组与其阴性对照组相比，胞内caspase-1和IL-18蛋白表达以及细胞上清中的IL-1β和IL-18水平明显降低(P<0.05)，其他炎症小体相关分子表达有降低趋势(P>0.05)。
4.ERK/NF-κB通路参与miR-155诱导的NLRP3炎症小体激活：Westernblot检测结果显示，miR-155上调组细胞在NLRP3炎症小体过度激活的同时伴有ERK/NF-κB通路磷酸化水平明显增加；而miR-155下调组ERK/NF-κB通路磷酸化水平则显著下降(P<0.05)。我们进一步在上调miR-155基础上应用U0126发现miR-155mimics+U0126组和miRNAmimics+U0126组细胞内ERK/NF-κB通路磷酸化水平明显低于其阴性对照组(P<0.05)；且miR-155mimics+U01126组的磷酸化水平下降程度高于miRNAmimics+U0126组。miR-155mimics+U0126组和miRNAmimics+U0126组细胞内NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表达明显降低(P<0.05)，培养液中的IL-1β和IL-18水平也明显下降(P<0.05)，且miR-155mimics+U0126组的炎症小体相关分子表达水平降低程度高于miRNAmimics+U0126组，与ERK/NF-κB通路磷酸化水平检测结果一致。
结论：
1.颈AS小鼠模型中上调miR-155可促进NLRP3炎症小体的激活，加重AS病变；抑制miR-155表达则可抑制炎症小体激活，减轻AS。
2.ox-LDL可能通过ERK/NF-κB信号通路诱导单核巨噬细胞NLRP3炎症小体激活。
3.miR-155可通过ERK/NF-κB通路对ox-LDL诱导的单核巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活发挥调节作用。
4.miR-155可能通过ERK/NF-κB通路调控NLRP3炎性小体激活参与AS的发生发展。