油茶炭疽病原真菌Colletotrichum fructicola效应蛋白的筛选及功能验证

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油茶(Camelliaoleifera)作为农村兴林富民的主导产业和脱贫攻坚的民生产业,一直备受关注。油茶炭疽病是我国油茶种植区常见的重要病害,它引起严重落果、落蕾,甚至整株衰亡。效应蛋白是病原真菌侵染植物宿主过程中分泌的致病因子,在致病过程中有着至关重要的作用。本论文研究对油茶炭疽病的主要致病菌果生刺盘孢(Colletotrichum fructicola)在死体营养期分泌效应蛋白的种类进行预测筛选并验证其功能,了解这些效应蛋白的功能和作用规律对预防油茶炭疽病的扩散及揭示油茶-炭疽病互作机理有着积极意义。本论文取得以下研究结果:1.C.fructicola死体营养期候选效应蛋白预测筛选。选取96h处于死体营养期的炭疽菌-油茶病斑组织做转录组测序,转录组结果数据显示侵染时期相对于分生孢子时期有7850个差异表达基因,对差异表达基因的编码蛋白进行预测分析,发现其中345个为经典分泌蛋白。以氨基酸长度<300和半胱氨酸残基数≥4为筛选条件,过滤已经注释过功能的蛋白,最终筛选出17个候选效应蛋白。针对筛选得到的17个候选效应蛋白进行同源性比较,发现候选效应蛋白在与植物病变相关的真菌类致病菌中也存在同源性较高的蛋白。2.C.fructicola候选效应蛋白的功能验证。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达体系验证候选效应蛋白的功能。鉴定到CfEP1、CfEP2、CfEP3、CfEP4、CfEP6、CfEP15均不同程度的引起烟草叶片的皱缩、变薄、干枯等坏死现象;候选效应蛋白与Bax蛋白1:1混合共注射结果显示,17个候选效应蛋白未表现出抑制细胞坏死的功能;亚细胞定位结果显示具有诱导坏死功能的候选效应蛋白拍摄不到荧光信号,在与Bax共注射的结果同样如此,推测叶片细胞死亡会影响融合蛋白的荧光表达。3.C.fructicola候选效应蛋白qRT-PCR定量分析。分选分生孢子时期、营养生长48h、72h、96h以及侵染油茶叶片48h、72h、96h七个时间段,对17个候选效应蛋白的基因进行定量分析,发现其中诱导细胞死亡效果最好的CfEP15在48h时表达量最高,并且在之后的侵染阶段持续表达,推测该蛋白在C.fructicola侵染油茶过程中起非常关键的作用。综上所述本文筛选得到C.fructicola死体营养期17个候选效应蛋白;构建瞬时表达载体成功验证出CfEP1、CfEP2、CfEP3、CfEP4、CfEP6、CfEP14、CfEP15候选效应蛋白具有引起烟草叶片坏死的功能;通过多时间段的定量分析,得出候选效应蛋白的表达规律。丰富了C.fructicola效应蛋白数据,为其他寄主植物抗炭疽病提供有利参考,同时为研究果生刺盘孢侵染油茶的分子机理,为油茶抗病品种的选育提供依据。
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