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第一部分海藻酸钠凝胶的制备及对成血管因子的封装目的：设计并合成具有一定生物活性的海藻酸钠凝胶,观察其显微结构;并封装成血管生长因子VEGF和bFGF,测定并比较海藻酸钠对这两种生长因子的释放规律。方法：购买天然的高分子量及低分子量海藻酸钠大分子,通过高碘酸钠氧化修饰法部分氧化海藻酸钠分子；氧化型的高分子量及低分子量海藻酸钠溶解后,按照1：1等体积混合后,在二价钙离子的作用下发生交联反应形成凝胶,扫描电镜下观察其显微结构；同时加入VEGF及bFGF一起形成凝胶,通过酶联免疫吸附实验测定两种因子的释放规律。结果：成功合成了海藻酸钠凝胶,并完成了凝胶对VEGF及bFGF的封装。扫描电镜下显示凝胶内部呈多孔网状结构,孔隙直径在10 μ m左右；ELISA结果显示：短时程内,两种生长因子都平稳缓慢释放,在24h时释放率达到20%左右；长时程内,两种生长因子释放速度也较平稳,第七天时释放速度明显加快,释放率达到85%左右。采用配对资料的t检验发现,海藻酸钠凝胶对两种生长因子的释放率没有统计学差异。结论：海藻酸钠能够形成凝胶,而且能封装生长因子VEGF和bFGF;封装后,能较平稳释放生长因子,在一周左右有一个释放高峰；海藻酸钠能保证两种生长因子的协同释放。第二部分内皮祖细胞的分离培养鉴定及与海藻酸钠凝胶的负荷目的：分离培养大鼠骨髓来源内皮祖细胞,观察内皮祖细胞的生物特点,并鉴定其表面标志物；用海藻酸钠凝胶封装VEGF及bFGF,同时负荷内皮祖细胞共培养,观察海藻酸钠凝胶对内皮祖细胞生长的影响。方法：分离SD大鼠骨髓,采用密度梯度离心法获得单个核细胞；用EGM培养基诱导培养,根据差速贴壁原理,分别获得早、晚期内皮祖细胞；倒置显微镜下观察两种内皮祖细胞的原代生长规律；晚期内皮组细胞经传代培养后采用流式细胞术检测其表面标记CD34及VEGFR2的阳性率,免疫荧光法观察这两种表面分子的染色情况。使用封装有VEGF及bFGF的海藻酸钠凝胶负荷内皮祖细胞,使用细胞计数法观察内皮祖细胞单独培养及与凝胶共培养时的生长速度。结果：我们成功分离培养了大鼠骨髓来源的内皮祖细胞：早期内皮组细胞在种植两天后贴壁,四天左右开始出现“集落”,一周时观察到典型的“内皮祖细胞集落”,其特点是中央为大量圆球形细胞,周围梭形细胞呈放射状排列；晚期内皮祖细胞在第五日二次贴壁后呈圆球形,之后大量扩增,两周时达到80%融合,呈典型的“铺路石”样外观。免疫荧光检测显示内皮祖细胞VEGFR染色较强,而CD34分子染色较弱；流式细胞术检测显示VEGFR2和CD34双阳性细胞比例为(1.50±0.04)%;VEGFR2单阳性细胞比例为(18.50±0.12)%；CD34单阳性细胞比例为(2.41±0.08)%。细胞生长曲线测试显示与单纯内皮祖细胞培养相比,海藻酸钠凝胶共培养使细胞增殖更平稳,增殖期延长。结论：密度梯度离心法结合差速贴壁原理能够获得稳定传代的大鼠骨髓来源内皮祖细胞,为后续的组织工程研究提供“种子细胞”；海藻酸钠凝胶与内皮祖细胞有良好的生物相容性,与VEGF及bFGF一起可以促进内皮祖细胞的生长和增殖。第三部分封装成血管因子VEGF及bFGF的海藻酸钠凝胶负荷内皮祖细胞在大鼠皮肤创面模型中促血管生成的效果的观察目的：观察封装成血管因VEGF及bFGF的海藻酸钠凝胶,负荷大鼠内皮祖细胞在大鼠皮肤创面模型中促血管生成的效果,并探讨其可能的机制。方法：取SD大鼠24只,随机分为A、B、C、D四组,设计大鼠背部创面模型；A组大鼠背部创面移植单纯的海藻酸钠凝胶,B组大鼠背部创面移植封装有VEGF及bFGF的海藻酸钠凝胶,C组大鼠背部创面移植负荷有内皮祖细胞的海藻酸钠凝胶,D组大鼠背部创面移植封装有VEGF及bFGF、同时负荷内皮祖细胞的海藻酸钠凝胶。连续大体观比较创面愈合的基本情况；术后7天时,活体成像显微镜下观察各组大鼠创面血管密度及血液供应的基本情况；处死大鼠并分离创面组织,HE染色观察创面的组织变化情况；免疫荧光法检测各组创面Ang-1及VEGFR抗原的表达情况；实时荧光定量PCR检测创面组织中PECAM1、 VE-cadherin、Flk-1 mRNA的转录水平。结果：大体观见D组大鼠创面造模后4天伤口已明显干燥、结痂,在术后一周时形成了一层痂皮保护层,显示创面愈合较其他组快；活体成像显微镜结果示A、B、C、D四组大鼠创面血管平均计数依次分别为(条)：4.0±0.8；12.5±1.3；14.0±0.8；27.8±2.5。A组的血管数与B、C、D组对比有统计学差异(P<0.05)；D组的血管数与B、C组对比有统计学差异(P<0.05)。A、B、C、 D四组大鼠创面的平均血流速度依次分别为(μm/秒)：41.60±1.76；53.45±1.67；55.03±1.50；64.88±2.12。A的血流速度与B、C、D组均有统计学差异(P<0.05)；B、C组与D组对比均有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光法显示D组荧光强度最高。实时荧光定量PCR结果显示A、B、C、D四组大鼠创面组织中PECAM的mRNA相对表达量依次为0.198±0.021；0.393±0.027；0.409±0.019；0.805±0.017。A组与B、C、D组对比差异有统计学意义；B、C组与D组对比差异有统计学意义(P<0.05)。四组的VE-cadherin mRN A相对表达量依次为0.479±0.008；0.507±0.007；0.494±0.005；0.871±0.023。D组与A、B、C组对比差异有统计学意义；A、B、C三组之间相互对比差异无统计学意义(P<0.05)。四组的Flk-1 mRNA相对表达量依次为0.186±0.017；0.406±0.010；0.404±0.008；0.690±0.020。A组与B、C、D组对比差异有统计学意义；B、C组与D组对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论：封装VEGF及bFGF的海藻酸钠凝胶,同时负荷内皮祖细胞用于大鼠背部创面的损伤修复,在宏观上可以促进创面的结痂及炎症反应的消退,增加创面血管密度及改善血供；微观上可以增加创面组织中相关血管营养因子比如PECAM、 VE-cadherin及Flk-1的(?) RNA的表达,而这些因子与血管的营养和再生有密切联系。以上结果提示该种方法可能在创面修复过程中有促进血管新生、改善创面血供的作用,在今后关于创面修复的组织工程学研究方面具有良好的应用前景。