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研究背景急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection,ARTI)在各年龄段儿童中是一种常见疾病,尤其在小于5岁儿童中常见。ARTI症状轻者可表现为扁桃体炎,较严重者可因重症肺炎及其并发症导致死亡,其高住院率及死亡率为社会带来沉重负担。急性呼吸道感染的主要病原体,以呼吸道病毒为主,呼吸道病原体混合感染在儿童ARTI中的检出率在30%至50%不等,准确地检测呼吸道感染的病原体,对于临床合理用药治疗具有重要意义。目前,临床实验室主要采用荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,qPCR)方法,人工提取核酸耗时较长且无法在一次反应中同时检测多达十余种病原体。随着多重PCR技术的成熟,市面上逐渐出现商品化的多重PCR检测体系,如Filmarray呼吸道病原体检测平台,是基于巢式多重qPCR方法的呼吸道病原体快速检测平台,可在70分钟内于密闭反应条中自动完成核酸提取、逆转录、qPCR步骤,检测1份样本中18种呼吸道病原体,虽其成本较高,但具有不依赖PCR实验室条件、快速、病原谱广的优点,适合应用于门诊的急重症患者;海尔施呼吸道病原体多重检测体系,是基于多重PCR及毛细管电泳分离法的检测体系,依赖于PCR实验室条件及人工操作,在一次反应中可同时对180份样本完成共14种常见呼吸道病原体的检测,具有通量大、成本低的特点。这些多重PCR检测体系,都有助于实现临床实验室在短时间内完成对多种呼吸道病原体的检测,但尚未获得CFDA认证,需开展临床应用及评估,以尽快投入临床检测中使用。腺病毒(Adenovirus,ADV)作为一种儿童急性呼吸道感染常见病原体,在各地区ARTI儿童中的检出率由5%至25%不等,且主要在5岁以下儿童检出。有研究发现,从重症肺炎患儿中分离的腺病毒较多见的为7型腺病毒(ADV-7),推断ADV-7与儿童重症肺炎有密切关系,然而,对不同血清型腺病毒引起的临床症状作系统、大量数据分析的研究仍然较少见,且研究入组例数较少,不足以明确ADV-7较其余血清型更易引起儿童重症肺炎,ADV-7在重症肺炎中的致病机制尚未明确。研究目的1.评估多重呼吸道病原体分子检测体系的临床应用,旨在为临床检验实验室针对不同需求的患者应用快速、准确的检测方法提供参考。2.通过调查呼吸道感染住院儿童中常见病原体的流行情况、混合感染检出率及混合感染与疾病严重程度的关系,在儿童ARTI病因学方面为临床提供参考;探讨上呼吸道、下呼吸道样本中检出病原体的相关性,为临床采样方法的选择提供科学依据。3.探讨各血清型腺病毒在呼吸道感染住院儿童中的流行情况、不同血清型与患儿临床病情发展的相关性,明确重症患者腺病毒基因组特征,为腺病毒致病机制的研究提供流行病学资料。研究方法1.建立分别针对常见呼吸道病原体的检测体系,包括甲型流感病毒(Influenza A virus,IFA)、乙型流感病毒(Influenza B virus,IFB)、1~4型人副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV),呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)、腺病毒(Adenovirus,ADV)、鼻病毒(Rhinovirus,RV)、肠道病毒(Enterovirus,EV)、人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)、冠状病毒(Coronavirus,CoV)OC43,CoV NL63,CoV 229E、CoV HKU1、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis,BP)18种常见呼吸道病原体的自建荧光定量PCR(Realtime quantative PCR,qPCR)检测体系,与基于巢式多重qPCR法的Filmarray,及基于多重PCR和毛细管电泳方法的海尔施14种呼吸道病原体多重检测体系,共三种检测体系,共同检测55例诊断为急性呼吸道感染住院儿童55份NPS及30份BALF中的病原体。比较三种检测体系的结果,分析各病原体及混合感染的检出率、混合感染与临床特征的关系,并研究患儿上、下呼吸道样本检测结果相关性。2.对2014年6月至2016年8月期间广州医科大学附属第一医院及广州市妇女儿童医院共240例住院患儿的腺病毒阳性核酸样本,以qPCR及一代测序方法进行血清型分型,统计各血清型检出率。收集所有患儿临床特征资料,分析不同血清型ADV与ARTI患儿临床特征的相关性。3.通过基于高通量测序技术的宏基因组学方法,获得腺病毒感染重症患者7型ADV全基因组序列,对ADV-7全基因组及各个主要功能基因作基因突变和进化分析。研究结果1.Filmarray共从41例(74.5%)ARTI住院患儿的NPS中检出至少1种呼吸道病原体,混合感染的检出率为40%(22/55)。RV为检出率最高的病原体,其次为MP和RSV,RV与MP合并感染为最常见混合感染模式。单一病原体感染与混合感染患儿的临床特征差异未见统计学意义。共76.7%患儿(23/30)NPS样本中检出的病原体可包括其BALF中检出的病原体,53.3%(16/30)患儿NPS与BALF中检出的病原体完全一致。通过Filmarray、海尔施、自建qPCR检测体系均得到基本相符结果。Filmarray与自建qPCR检测结果一致率达84.7%,海尔施与自建qPCR检测结果一致率达75.4%。2.3型腺病毒为2014年至2016年主要流行的腺病毒血清型,占77.5%,其次为7型腺病毒,占20.4%。ADV-7感染患儿中2岁以下儿童比例高于ADV-3感染患儿,且ADV-7感染患儿的肺炎、重症肺炎、并发症、胸腔积液、需机械辅助通气发生率显著高于ADV-3感染患儿(P<0.01)。3.通过高通量测序,组装获得1例重症肺炎患者7型腺病毒全基因组序列,与基因数据库中ADV-7基因组比较,未发现该例ADV-7存在大片段变异。通过进化分析发现,ADV-7全基因组与2011年广州地区一例重症死亡病例中分离的ADV-7同源性最高,ADV-7全基因组及Hexon、Fiber、E3区域基因与近年来中国地区ADV-7均有高度同源性。本研究ADV-7全基因组与2011年广州地区重症死亡病例的ADV-7全基因组相比,在转录相关蛋白55 kDa外显子1发现一处C3218A碱基突变,为同义突变。研究结论三种呼吸道病原体检测体系的检测结果相互之间基本相符,方便临床为不同需求患者提供适宜的检测体系。三种检测体系共同验证了混合感染在急性呼吸道感染住院患儿中有较高的检出率,但与临床特征的相关性需要进一步研究。上、下呼吸道样本中病原体有较高一致性,采集鼻咽拭子进行检测可一定程度预测下呼吸道病原体,有简便、无创的优势。3型腺病毒在2014年至2016年为主要流行血清型,而7型腺病毒与儿童重症肺炎有密切关系。7型腺病毒全基因组及各主要功能基因均高度保守,未发生明显突变。7型腺病毒并非通过突变引起儿童重症肺炎,其在嗜性、复制能力、及引起宿主免疫反应方面的致病机制值得进一步研究。