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癫痫是常见的神经系统慢性疾病,在神经系统疾病中,其发病率仅次于脑卒中,在世界范围内约有五千万人患有癫痫。癫痫是由于反复高度同步的脑部神经元异常放电而引起的认知、感觉、和(或)运动功能异常的脑功能障碍综合征。癫痫患者中约有30%伴有不同程度的认知功能损害,可表现为:学习记忆能力减退、情感行为异常、社会适应能力下降等。近年来癫痫中的认知功能障碍日益成为研究的热点。癫痫引起认知功能障碍的机制迄今还未完全阐明,目前认为,认知功能损害可能与痫性发作潜在的病因、反复痫性发作引起的脑损害、抗癫痫药物的副作用等有关,认知功能障碍呈慢性存在,随着反复的痫性发作而逐渐进展。现有的抗癫痫药物中有些对认知功能有不良后果,有些对认知功能的影响还不明确。因此,具有抗癫痫作用,同时改善认知功能的药物亟待发现。氧化应激和线粒体功能障碍与癫痫发生、癫痫的进展以及认知障碍有密切关系。氧化应激是指氧化负荷与机体抗氧化系统的失衡状态。机体氧化负荷,例如:活性氧自由基的生成,超过了机体内源性抗氧化和修复能力时称为氧化应激。越来越多的证据表明,氧化应激与癫痫的发生、发展密切相关。氧化应激使细胞蛋白、膜脂质、核DNA过度氧化,引起线粒体结构和功能的改变,破坏线粒体氧化磷酸化功能,使得自由基生成进一步增加、抗氧化系统被削弱,从而形成恶性循环。人类和动物研究中均发现抗氧化剂补充能够预防癫痫的进展。线粒体是活性氧自由基生成的主要场所,也是活性氧自由基损伤的首要靶点。活性氧自由基损伤线粒体,使其功能下降,氧化磷酸化受到抑制,活性氧自由基的生成将进一步增加,从而形成恶性循环。氧化应激和线粒体功能障碍有可能成为治疗癫痫的重要靶点。二甲双胍(metformin,MET)从20世纪50年代起广泛应用于2型糖尿病的治疗。近来发现MET除了在治疗糖尿病方面的作用外,还兼具抗氧化、抗炎、抗衰老、抑制肿瘤等多种生物学特性。同时非常重要的是,MET能够快速通过血脑屏障而发挥其神经保护作用。研究发现,MET通过抑制线粒体呼吸能够减少活性氧自由基的生成,减少DNA损伤;MET还能够对机体抗氧化系统起保护作用,MET能上调转录因子NF-E2相关因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)靶基因的活化、谷胱甘肽和解偶联蛋白-2(uncoupled proteins 2,UCP2)的表达。除此之外,MET能够增强正常C57BL/6小鼠和高脂肪饮食大鼠的空间学习记忆能力。在多种神经系统疾病动物模型,如多发性硬化、脑卒中和Alzheimer’s病,MET都表现出具有神经保护和治疗作用。MET对于癫痫的神经保护作用还未见报道。本实验通过亚惊厥剂量戊四氮(pentylenetetrazoloe,PTZ)多次腹腔注射建立点燃癫痫小鼠模型,给予MET进行干预,观察MET对癫痫小鼠痫性发作、认知功能、脑组织氧化应激指标及对海马组织神经元的影响,探讨MET的保护作用及其可能的机制。为明确癫痫的病理生理机制提供实验依据,为癫痫治疗提供新的思路。第一部分二甲双胍对戊四氮致痫小鼠痫性发作和认知功能的影响目的:建立戊四氮点燃慢性癫痫小鼠模型,观察戊四氮点燃小鼠痫性发作、Morris水迷宫表现,及二甲双胍对戊四氮点燃小鼠行为学表现的影响。方法:6-8周龄清洁级健康雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:正常对照组(CON组);模型组(PTZ组);二甲双胍干预癫痫小鼠组(PTZ+MET组)和单独二甲双胍给药组(MET组)。MET和PTZ于每次给药前分别溶于生理盐水新鲜配制,均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。CON组小鼠隔日腹腔注射0.9%Nacl(10ml/kg),共14次;PTZ组小鼠腹腔注射PTZ(37mg/kg),共14次,在每次注射PTZ之前30min给予腹腔注射0.9%Nacl(10ml/kg);PTZ+MET组隔日腹腔注射PTZ 37mg/kg,每日腹腔注射200mg/kg MET;MET注射30分钟后再给予PTZ腹腔注射;MET组小鼠每日予MET 200mg/kg腹腔注射。每次PTZ腹腔注射后,观察30分钟小鼠的行为,参照Racine分级标准,记录痫性发作等级。标准如下:0级,行为正常,无异常表现;1级,面肌痉挛,包括胡须抖动频繁、节奏性咀嚼;2级,点头样颈部肌阵挛表现;3级,沿身体纵向抽搐;4级,双侧前肢阵挛;5级,全身强直-阵挛大发作,或死亡。最后一次PTZ给药24小时后,行Morris水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力。Morris水迷宫实验内容包括:(1)定位航行实验:以测试大鼠的空间学习能力,实验共进行5天。每天训练4次,训练时大鼠分别按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限顺序分别作为四个入水点,将小鼠面朝池壁轻轻放入水中,记录60s内大鼠从入水至爬上水下平台花费时间为逃避潜伏期,每次训练间隔15min。当60s时小鼠仍未找到水下平台时,将小鼠放至平台上休息15s,将潜伏期记录为60s。(2)空间探索实验:以检测大鼠的空间记忆能力。空间航行实验进行5天后,将水下平台撤去,以和平台区域相对的象限中点为入水点,记录小鼠在60s内为搜索水下平台,在原平台所在象限的游泳时间和穿越平台区域的次数。(3)可视平台实验:以排除动物视觉、运动功能的差异对小鼠空间学习记忆能力的影响。将水下平台高度调整至水面上1.5cm,每只小鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限顺序分别作为四个入水点,记录小鼠逃避潜伏期和游泳速度。结果：1多次腹腔注射亚惊厥剂量PTZ后,小鼠出现痫性发作,从凝视、点头样动作、洗脸样动作起,发作等级逐渐升高,出现身体纵向抽搐、双侧前肢痉挛等,最终出现全身强直-阵挛大发作。MET干预能够有效降低戊四氮点燃小鼠痫性发作等级(P<0.01)。CON组和MET组动物未出现痫性发作。2 Morris水迷宫结果提示:在定位航行实验中,随着水迷宫训练的进行,各组小鼠的逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势,但PTZ组小鼠逃避潜伏期时间最长,各组在组间(F=86,821,P<0.01)、不同时间点间(F=789,315,P<0.001)和组间?时间点间交互作用(F=20,791,P<0.001)的差异均有统计学意义。各组间目标象限停留时间有统计学差异(P<0.001)。两两比较后发现,PTZ组小鼠逃避潜伏期与CON组相比明显延长(P<0.01);MET治疗后显著缩短了逃避潜伏期(P<0.01);MET组和CON组相比,逃避潜伏期无明显差异(P>0.05)。在空间探索实验中,60s内穿越平台区域的次数各组间存在有显著差异(P<0.01)。两两比较结果提示,PTZ组小鼠60s内穿越平台所在区域的次数显著低于CON组(P<0.01);MET治疗后癫痫小鼠60s内穿越平台区域的次数与PTZ相比明显增加(P<0.01),与CON组相比无统计学差异(P>0.05);MET组与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。各组小鼠在60s内在平台所在象限的游泳时间相比有显著统计学差异(P<0.01)。与CON组相比,PTZ组小鼠在平台所在象限的游泳时间明显缩短(P<0.01);MET治疗后显著增加了癫痫小鼠在平台所在象限的游泳时间;MET组小鼠在平台所在象限的游泳时间和CON组相比无明显统计学差异(P>0.05)。可视平台实验中,各组小鼠的逃避潜伏期和游泳速度的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在戊四氮点燃小鼠模型中,MET干预明显降低了痫性发作等级、延缓了戊四氮点燃进程,表明MET具有抗癫痫作用;MET干预后的癫痫小鼠在Morris水迷宫中空间学习记忆能力比癫痫组小鼠明显增强,表明MET对戊四氮点燃模型中的认知功能障碍有显著的改善作用。第二部分二甲双胍对戊四氮致痫小鼠脑氧化应激状态的影响目的:研究二甲双胍对癫痫小鼠脑组织中氧化应激和线粒体损伤是否具有保护作用。方法:6-8周龄清洁级健康雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:正常对照组(CON组);模型组(PTZ组);二甲双胍干预癫痫小鼠组(PTZ+MET组和单独二甲双胍给药组(MET组)。MET和PTZ于每次给药前分别溶于生理盐水新鲜配制,均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。CON组小鼠隔日腹腔注射0.9%Nacl(10ml/kg),共14次;PTZ组小鼠腹腔注射PTZ(37mg/kg),共14次,在每次注射PTZ之前30min给予腹腔注射0.9%Nacl(10ml/kg);PTZ+MET组隔日腹腔注射PTZ 37mg/kg,每日腹腔注射100mg/kg MET;MET注射30分钟后再给予PTZ腹腔注射;MET组小鼠每日予MET 200mg/kg腹腔注射。最后一次给予PTZ注射24小时后,各组小鼠颈椎脱臼处死,快速取脑,应用试剂盒检测GSH活力和MDA含量;应用流式细胞仪检测海马组织细胞内ROS和线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,△Ψm)的水平;透射电镜观察海马组织CA1区线粒体的超微结构。结果：1与CON组相比,PTZ组小鼠脑组织中GSH含量明显降低(P<0.01);MET治疗后癫痫小鼠脑组织中GSH含量明显升高了(P<0.01)。与CON组相比,PTZ组MDA含量显著升高(P<0.01);MET治疗后癫痫小鼠脑组织中MDA含量显著降低(P<0.01)。CON组和MET组小鼠脑组织中GSH、MDA含量相比较无统计学差异(P>0.05)。2与CON组相比,癫痫小鼠海马组织中ROS的水平明显升高(P<0.01),△Ψm水平显著下降(P<0.01);与PTZ组相比,MET治疗后癫痫小鼠海马组织中ROS水平显著下降(P<0.01),△Ψm水平明显升高(P<0.01)。CON组和MET组小鼠海马组织中ROS水平和△Ψm水平相比较均无统计学差异(P>0.05)。3癫痫小鼠海马组织CA1区线粒体超微结构出现明显改变,表现为线粒体空泡化,线粒体嵴断裂;MET治疗后可明显改善线粒体的超微结构改变。CON组和MET在小鼠海马组织CA1区线粒体超微结构正常。结论:戊四氮点燃小鼠脑内存在有氧化应激改变,线粒体是脑内自由基损伤的靶点。MET可调节小鼠脑内的氧化应激水平,能够改善海马组织中线粒体结构和功能。第三部分二甲双胍对戊四氮致痫小鼠海马组织神经元的保护作用目的:观察MET对戊四氮点燃小鼠海马组织Nissl染色结果、海马组织细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的影响,探讨MET对癫痫小鼠海马组织的保护作用。方法:6-8周龄清洁级健康雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:正常对照组(CON组);模型组(PTZ组);二甲双胍干预癫痫小鼠组(PTZ+MET组和单独二甲双胍给药组(MET组)。MET和PTZ于每次给药前分别溶于生理盐水新鲜配制,均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。CON组小鼠隔日腹腔注射0.9%Nacl(10ml/kg),共14次;PTZ组小鼠腹腔注射PTZ(37mg/kg),共14次,在每次注射PTZ之前30min给予腹腔注射0.9%Nacl(10ml/kg);PTZ+MET组隔日腹腔注射PTZ 37mg/kg,每日腹腔注射100mg/kg MET;MET注射30分钟后再给予PTZ腹腔注射;MET组小鼠每日予MET 200mg/kg腹腔注射。最后一次PTZ给药24小时后,各组取小鼠取脑,Nissl染色法观察小鼠海马组织神经元,检测海马组织CA1和CA3区存活神经元的数目;应用流式细胞仪定量分析小鼠海马神经元凋亡情况;Western-blot定量分析海马组织中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果：1 Nissl染色:CON组小鼠海马组织CA1和CA3区的神经细胞形态完整,胞浆内尼氏小体丰富,没有明显神经细胞丢失,锥体细胞排列规则紧密;癫痫小鼠海马组织CA1和CA3区可见明显的神经元丢失,细胞排列紊乱,可见明显的细胞皱缩,尼氏小体数量下降、染色质凝集、核固缩;MET干预后癫痫小鼠海马组织神经元结构正常,尼氏小体数量较癫痫组明显增加,神经元丢失较癫痫组明显改善;仅给予MET的小鼠海马组织神经元结构、形态与CON组相比没有明显差异。海马神经元存活数量:与CON组相比较,PTZ组小鼠海马CA1区和CA3区神经元数量均明显下降(P<0.05),MET治疗后明显增加了存活的神经元数量(P<0.05)。MET组和CON组间海马组织神经元存活数量无明显统计学差异(P>0.05)。2细胞凋亡率:与CON组相比较,PTZ组小鼠海马组织凋亡率明显增加(P<0.05);与PTZ组相比,MET治疗后癫痫小鼠海马组织凋亡率明显下降(P<0.05)。MET组和CON组小鼠海马组织凋亡率无显著差异(P>0.05)。细胞凋亡率的结果与Nissl染色的结果一致。3 Bcl-2和Bax的表达:与CON组相比较,PTZ组小鼠海马组织Bcl-2的表达明显下降(P<0.05),Bax的表达明显升高(P<0.05);MET干预后癫痫小鼠海马组织Bcl-2的表达明显升高(P<0.05),Bax的表达明显下降(P<0.05)。MET组和CON组小鼠海马组织Bcl-2和Bax的表达无显著差异(P>0.05)。结论:戊四氮点燃模型中,小鼠海马组织出现明显的损伤,MET能够保护海马组织神经元的形态,减少神经元的凋亡。