降低成人原代肝细胞免疫原性及其对细胞稳定性的影响

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目的:研究紫外线照射对成人原代肝细胞活率及膜电位的影响,通过混合淋巴细胞-肝细胞培养,探讨紫外线照射降低成人原代肝细胞的免疫原性的可行性及稳定性。  方法:收集我院肝胆外科切除肝组织手术标本,诊断为肝脏良性病变(肝血管瘤、肝内胆管结石等),采用灌注法获得肝细胞;将实验肝细胞分为5个组,1个对照组(0 J/m2)及4个不同照射强度组(分别为200、350、550和750J/m2)。紫外灯功率固定,照射强度由照射时间调控,5组照射强度所对应的照射时间分别为0、2、4、6和8分钟。各组分别于处理后培养的第1、3、5天进行相关检测:台盼蓝拒染法和CCK-8法检测细胞活率;荧光显微镜和多功能酶标仪检测细胞膜电位变化;通过混合淋巴细胞-肝细胞培养(MLHC)检测受体T细胞增值情况;收集实验组和处理组的培养上清液,离心后全自动生化分析仪检测白蛋白、LDH的分泌量。  结果:⑴改良的两步胶原酶灌注获得的肝细胞透亮,呈圆形或球形,胞质均匀,肝细胞总数可达109个以上,活率大于90%。⑵UVB照射新鲜分离的肝细胞,在照射强度相同的条件下,随着照射后培养时间的延长,成人原代肝细胞活率呈现下降趋势。照射后第1天活率最好,随着培养时间的延长,活率下降,到第五天,活率下降1/2;在照射后培养时间相同的情况下,随着照射强度的增加,肝细胞活率呈先上升后降低。照射2min后的肝细胞活率最高,较未照射组高,但差异不明显,活率明显高于4min、6min组,是照射8min组的2倍。⑶不同的UVB照射强度和UVB照射后不同培养时间之间,成人原代肝细胞的膜电位均有明显差异。UVB照射2min组的膜电位在照射后的各个时间点均比UVB照射肝细胞0min、4min、6min、8min组的膜电位高。⑷肝细胞在接受不同强度紫外线照射后,与淋巴细胞混合培养,照射后的肝细胞免疫原性下降,表现为共培养的淋巴细胞增值能力下降。2min组与对照组无明显区别,但明显低于4min、6min、8min组。⑸检测不同照射强度、培养时间的白蛋白、LDH分泌量,接受2min紫外线照射的肝细胞分泌功能最好,随着照射强度的增大和培养时间的延长,肝细胞合成和分泌功能下降。  结论:混合淋巴细胞-肝细胞培养可以用来检测受体淋巴细胞对供体肝细胞反应的指标,照射2min时共培养的T细胞增值能力最低,提示此时肝细胞的免疫原性最小。
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