大白菜硫甙合成基因特异SSR标记的开发和应用

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dingxiaoyun
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硫代葡萄糖甙(简称硫甙,Glucosinolate)是十字花科重要的一种次生代谢产物,是白菜类作物(Brassica campetris syn. rapa,2n=20)中的重要营养物质成分。但是,直接测定硫甙含量费时费力,在育种过程中不宜直接选择。有必要在分子水平上对硫甙含量和不同组分的变异特点进行研究,从而能够进一步发掘优异基因资源。本研究根据大白菜基因组序列信息,针对大白菜硫甙合成相关的所有基因开发特异SSR位点,分析其重复类型和分布特点;结合开发出的分布于全基因组水平的InDel标记,分析在75份不同类型的大白菜自交系中扩增的效果和多态性水平;通过HPLC(高效液相色谱)方法分别在苗期(定植后35天)和成熟期(适宜采收期)测定叶片硫甙含量,解析其变异特点;通过关联分析,获悉与大白菜硫甙含量相关的SSR等位基因或位点及InDeL标记。为分子标记辅助选择育种提供基础材料,加快大白菜营养品质育种的进程。主要研究结果如下:1.比对拟南芥和大白菜硫甙生物合成相关基因的序列信息,发现拟南芥的52个硫甙合成基因在大白菜中的同源基因个数分别为:零拷贝基因8个、单拷贝基因13个、2拷贝基因17个、2个以上多拷贝基因14个。2.根据102个大白菜硫甙生物合成相关基因的上下游序列各5kb,共开发出237个SSR位点:16个基因没有发现SSR位点,72个基因存在1~4个SSR位点,5个基因存在5个SSR位点,4个基因存在6个SSR位点,4个基因存在7个SSR位点,1个基因存在8个SSR位点;所开发的SSR位点中,共发现4种重复类型,其中单核苷酸重复最多,共122个,占SSR总数的51.4%。其次是二核苷酸类型,共48个,占SSR总数的20.3%。三核苷酸重复类型最少,共7个,占SSR总数的3.0%。另外60个SSR无明显的重复类型。3.具有SSR位点的86个基因中,77个基因可以设计特异SSR引物。其中,49对特异引物在大白菜自交系中得到有效扩增,16对引物具有多态性,占全部引物的20.8%;18对引物无多态性,占全部引物的23.4%;15对引物杂带多,占全部引物的19.5%;另外28对引物无扩增产物,占全部引物的36.4%。最终,11对在供试的75份材料中获得了清晰多态性扩增产物,共检测出26个等位基因,平均每对引物检测到等位基因2.4个。4.开发设计的177对InDel引物,161对在供试的75份大白菜自交系中得到有效扩增,占全部引物的91.0%;61对获得了清晰多态性扩增产物,占全部引物的34.5%;61对引物共检测到161个多态性带,平均每对引物检测到2.6条带。其中,95对引物只检测到1条扩增带,31对检测到2条扩增带,24对检测到3条扩增带,6对检测到4条扩增带。5.在苗期,测定了68份大白菜自交系的叶片硫甙含量。结果表明不同基因型间各硫甙间含量差异较大,总硫甙含量变异幅度为0.734-11.189μmol/g DW;吲哚族硫甙平均含量高于脂肪族硫甙和芳香族硫甙,所占比例分别为49.9%、39.8%和10.6%。其中,3-吲哚-甲基硫甙(GBC)含量最高,占总硫甙含量的27.0%;4-甲氧基-3-吲哚甲基硫甙(4ME)和4-戊烯基硫甙(GBN)含量较高,分别占总硫甙含量的18.0%和15.9%;4-羟基-3-吲哚-甲基硫甙(4OH)含量最低,仅占硫甙总含量的0.6%。6.在成熟期,测定了68份大白菜自交系的叶片硫甙含量。结果表明不同基因型间各硫甙间含量差异较大,总硫甙含量变异幅度为1.918-17.357μmol/g DW;脂肪族硫甙和吲哚族硫甙的平均含量高于芳香族硫甙,所占比例分别为48.6%、41.7%和9.7%。其中,2-羟基-3-丁烯基硫甙(PRO)、4-戊烯基硫甙(GBN)、4-甲氧基-3-吲哚甲基硫甙(4ME)和3-吲哚-甲基硫甙(GBC)含量相当,分别占总硫甙含量的19.8%、19.7%、19.6%和19.0%。4-羟基-3-吲哚-甲基硫甙(4OH)含量最低,仅占硫甙总含量的0.7%。成熟期总硫甙和各个成分含量明显高于苗期,相差约2倍。7. GLM关联分析表明,以统计概率P值0.01为标准,共检测到与硫甙含量关联的SSR和IDENL分子标记97个,分布在大白菜10个连锁群中。检测到的连锁标记大多数与4OH、NAP、GBN相关。
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