中药材黄山药的微生物转化研究

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黄山药(Dioscorea panthaica)是我国特有的薯蓣科薯蓣属植物,其根状茎的主要成分薯蓣皂苷的糖配体是世界上合成多种激素药物的重要原料;近年来,由黄山药甾体总皂苷开发成的药物(如地奥心血康等)用于临床治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血等疾病显示出一定的疗效。但是,由黄山药甾体总皂苷制备的中药制剂,存在着药用成分复杂,药效不够理想,有效资源发挥作用不大等问题。因此,进一步开展黄山药药用成分的研究,对充分利用黄山药资源,发掘新的先导化合物,寻找开发药物的新方法、新途径都具有现实意义。 本文采用微生物转化方法,以黄山药根状茎干粉为基质,开展黄山药药用成分的生物转化研究。通过微生物作用,使其物质结构发生改变,转化获得新化合物或提高原药用成分含量。从而开发防治心脑血管疾病疗效好,低毒副作用的中药。 本论文采用单一菌株的固态转化方式,从200余株丝状真菌中筛选到两株转化效果明显,编号分别为YM 33182和YM 32139的菌株。依据菌株形态特征,结合分子生物学方法,鉴定菌株YM 33182为黑曲霉(Aspeigillus niger V.Tiegh.);菌株YM 32139为微紫青霉(Penicillium janthinellum Biourge)。通过单因素和多因子正交实验,确定黄山药微生物转化的条件。即选择马铃薯葡萄糖液体培养基为种子培养基培养3~4d,以7±1%的转化种子接种量接入固体转化培养基中,28±2℃转化培养12~15d。转化完毕后,70%的乙醇提取3次、过滤去沉淀、滤液浓缩后依次用90%、95%、95%的乙醇分级进行提纯,浓缩后,40℃干燥即得黄山药的微生物转化产物乙醇提取物。按此工艺,对菌株YM33182进行六批扩大转化试验,获得转化产物乙醇提取物408g。采用硅胶和凝胶色谱层析技术分离该菌的转化产物,获得4个单体化合物。经<13>C NMR和<1>H NMR波谱分析,分别鉴定为:β-胡萝卜苷(Daucosterol)、薯蓣皂苷次皂苷元B(Prosapogenin B)、薯蓣皂苷(Dioscin)、纤细薯蓣苷(Gracillin)。高效液相色谱(HPLC)分析表明,薯蓣皂苷次皂苷元B不存在于未转化的黄山药和菌株YM 33182发酵物中,是通过菌株YM 33182转化形成的。薯蓣皂苷次皂苷元B在菌株YM 33182转化产物乙醇提取物中的质量百分含量为10.77%。薯蓣皂苷和纤细薯蓣苷在菌株YM 33182转化产物乙醇提取物中的质量百分含量总和为24.3%,而薯蓣皂苷在黄山药乙醇提取物中的质量百分含量为24.6%。 另外,按照上述工艺,对菌株YM 32139进行两批扩大转化试验。从该菌的黄山药转化产物乙醇提取物中,分离获得1个主要单体化合物,鉴定为薯蓣皂苷元(diosgenin)。TLC和HPLC分析表明,薯蓣皂苷元不存在于黄山药的乙醇提取物和菌株YM 32139发酵物中,由菌株YM 32139转化形成。薯蓣皂苷元在菌株YM 32139转化产物乙醇提取物中的质量百分含量为20.85%。此外该菌的转化产物中化合物种类与原黄山药相比明显增加,而且转化产物化合物成分出现了根本变化,为中药材的药理活性的提升奠定了基础。上述两组实验结果证明,通过微生物转化作用,可以使黄山药的主要化学成分发生量和质变化。利用不同的微生物处理黄山药或其他中药成分,可以得到不同的产物,从而达到发掘新的药用物质,增加或改变其药效的目的。
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