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目的:骨关节炎（OA）是常见的退行性关节疾病,软骨细胞在该疾病的发生与发展中起着重要作用。然而,OA潜在的病理机制尚未被充分研究。因此,本论文拟通过研究Yes相关蛋白1（YAP1）调控软骨细胞自噬在OA中的作用和分子机制,初步阐明软骨细胞与OA发生发展之间的关系。研究方法:本论文使用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫组织化学、CCK-8实验、流式细胞检测细胞周期和凋亡技术、蛋白免疫荧光、蛋白免疫共沉淀、荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀等方法,研究YAP1调节的自噬在软骨细胞增殖、凋亡和分化中的作用机制。结果:为研究YAP1在OA发展中的角色,我们成功构建了小鼠的OA模型,并取膝关节软骨组织进行Real time PCR、Western blot和免疫组织化学（IHC）实验检测。实验结果显示YAP1在小鼠OA模型中表达水平较高,表明YAP1可能参与OA的发生,而抑制YAP1表达可能有助于抑制OA的发展。为进一步观察并检测YAP1对软骨细胞增殖、周期、凋亡和分化的影响,我们应用ATDC5软骨细胞作为实验对象,通过腺病毒过表达或敲低Yap1后检测细胞的增殖、周期和凋亡。结果显示,过表达Yap1抑制ATDC5细胞的增殖和周期运转,并促进ATDC5细胞凋亡;而敲低Yap1促进ATDC5细胞的增殖和周期运转,抑制该细胞凋亡。通过Real time PCR和Western blot技术研究YAP1调控ATDC5细胞分化的效果,发现过表达Yap1可以明显降低软骨细胞分化相关基因Runx2、Ocn和Col-1的mRNA及相应蛋白的表达;敲低Yap1则提高Runx2、Ocn和Col-1的mRNA及相应蛋白的表达。说明YAP1是骨关节炎的重要促进因子,可通过调控软骨细胞的增殖和凋亡来介导关节炎的发展,且YAP1的表达与软骨细胞分化相关基因Runx2、Ocn和Col-1的mRNA及相应蛋白的表达有关。为进一步研究细胞自噬对OA的影响,我们使用Western blot和Real time PCR检测YAP1表达对ATDC5细胞中自噬水平的作用。结果显示,过表达Yap1抑制ATDC5细胞中Beclin1和LC-3BII,敲低Yap1则促进ATDC5细胞中LC-3BII表达。通过免疫荧光检测和免疫共沉淀实验,发现YAP1与Beclin1在ATDC5细胞中共定位,并存在相互作用,其相互作用在OA组织中得到强化。在对YAP1和Beclin1的结构进行的生信学分析后,发现YAP1含有多个WW结构域,与YAP1和Beclin1的相互作用相关;且进一步发现WW结构域与抑制Beclin1泛素化的活性相关。上述结果表明YAP1可以通过与Beclin1相互作用,抑制Beclin1蛋白的泛素化修饰和降解,进而抑制Beclin1介导的细胞自噬,最终促进软骨细胞的凋亡、抑制软骨细胞增殖和分化。为研究YAP1的临床作用,以及YAP1在骨关节炎治疗的关键作用,我们检测7种药物Paracetamol、Diacerein、99Tc-MDP、DSG、O3、Vitamin C和Rapamycin对YAP1表达的影响。Western blot结果表明,7种药物均可以抑制YAP1的表达,并促进自噬相关蛋白Beclin1和LC-3BII的表达。为进一步研究药物抑制YAP1蛋白表达的分子机制,以ActD孵育ATDC5细胞1小时,再以治疗药物处理细胞10小时后,Real time PCR检测发现Paracetamol、Diacerein和99Tc-MDP通过作用于promoter抑制Yap1 mRNA的表达,而DSG、O3、Vitamin C、Rapamycin作用于3’UTR。荧光素酶报告基因系统的结果显示Paracetamol、Diacerein和99Tc-MDP抑制Yap1 promoter的活化,DSG、O3、Vitamin C、Rapamycin则可以促进Yap1 3’UTR的降解。为研究药物Paracetamol、Diacerein和99Tc-MDP对Yap1 promoter的作用机制,我们通过生物信息学分析,查询多个转录因子数据库,构建转录因子的过表达和敲低质粒,以及Yap1启动子的荧光素酶报告基因。通过检测Yap1启动子报告基因的荧光强度,发现敲低转录因子AP2α和SP1可以抑制Yap1 promoter的荧光素酶活性和Yap1mRNA表达;过表达AP2α和SP1激活Yap1 promoter,促进Yap1 mRNA表达。再经过染色质免疫共沉淀（ChIP）检测,显示转录因子AP2α和SP1可以结合在Yap1 promoter（-300,+20bp）。说明转录因子AP2α和SP1可以明显地调控Yap1启动子的活性。为进一步研究AP2α和SP1对软骨细胞的增殖、凋亡和分化的调控,我们使用CCK-8、流式细胞仪、Real time PCR方法检测敲低或过表达AP2α和SP1对ATDC5细胞增殖、凋亡和细胞分化基因的表达的影响,结果发现敲低AP2α和SP1促进ATDC5细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,促进细胞分化基因的表达;过表达则抑制ATDC5细胞的增殖,促进细胞的凋亡,抑制细胞分化基因的表达。揭示了AP2α和SP1在软骨细胞增殖、凋亡和分化调控中的重要地位。另外,为研究药物DSG、O3、Vitamin C和Rapamycin对Yap1 3’UTR的作用机制,我们查询Targetscan、miRNAMAP和microRNA.org等数据库,发现miR-103、miR-107、miR-124a、miR-129-3p、miR-299、miR-5624-5p、miR-33-3p和miR-6918-5p等miRNAs可能结合在Yap1的3’UTR。再通过荧光素酶报告基因系统、Real time PCR、CCK-8和Annexin-V/PI检测过表达或敲低处理后的ATDC5细胞,发现miR-5624-5p、miR-33-3p和miR-6918-5p mimics明显降低Yap1 3’UTR的荧光素酶活性,其inhibitor可以促进Yap1 3’UTR的荧光素酶活性;三种miRNAs的inhibitor明显抑制ATDC5细胞的增殖,促进ATDC5细胞的凋亡,抑制ATDC5细胞的分化基因表达。揭示了miR-5624-5p、miR-33-3p和miR-6918-5p在骨关节炎中对Yap1的mRNA表达的调控作用。结论:（1）YAP1是骨关节炎的重要促进因子,抑制YAP1表达将有助于抑制骨关节炎的发展。（2）YAP1通过调控软骨细胞的增殖和凋亡行为来促进关节炎的发展,并影响软骨细胞的分化;还可以通过与Beclin1相互作用,抑制Beclin1介导的细胞自噬,促进软骨细胞的凋亡、抑制软骨细胞增殖和分化。（3）7种药物均可以抑制YAP1蛋白的表达,其中Paracetamol、Diacerein和99Tc-MDP作用于Yap1 promoter,DSG、O3、Vitamin C、Rapamycin则作用于Yap1 3’UTR。（4）转录因子AP2α和SP1和三种miRNAs（miR-5624-5p、miR-33-3p和miR-6918-5p）对YAP1的表达具有重要调控作用,也将是骨关节炎药物治疗的重要靶点。