论文部分内容阅读
家禽羽毛富含角蛋白是一种丰富的蛋白质资源，因其组成与结构的特殊性难于被动物消化利用。羽毛表层覆盖致密的疏水脂质层，形成羽毛与外界环境物质接触的屏障。内层为富含大量二硫键、氢键、疏水基团，结构稳定、不易降解的角蛋白。破坏羽毛表层脂质，增加蛋白酶与角蛋白结合，可加快羽毛降解速度。本论文通过对羽毛高效降解菌株地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）CP-16脂类水解酶对羽毛表层脂质水解的研究，探究脂类水解酶与角蛋白酶协同关系及其在微生物降解角蛋白中的作用。 B.licheniformis CP-16脂类水解酶基因在大肠杆菌中表达。在Uniprot中搜集B.licheniformis中脂类水解酶的3个酶蛋白核酸序列，根据序列设计引物，以B.licheniformis CP-16基因组DNA为模板，扩增脂类水解酶基因L-4，L-6，L-7，大小分别为747bp，783 bp，897bp。成功构建载体pET-22b-L-4、pET-22b-L-6、pET-22b-L-7。在大肠杆菌中表达、纯化，获得3种重组酶蛋白。 重组酶L-4、L-6、L-7酶学性质研究。重组酶L-4的最适pH为6.5，最适温度为50℃，在pH6.5～9.5、温度低于55℃的范围内酶活稳定，Fe2+、Na+、Mn2+、Ca2+(10 mmol/L)对其活性有促进作用。该酶在甲醇和二甲基亚砜(DMSO)中保存，活性可保留85％、97％，但其它有机溶剂的抑制作用明显。重组酶L-6的最适pH为7.5，最适温度为45℃，pH稳定性和温度稳定性相对较差，Zn2+、Cu2+、Fe3+(10 mmol/L)对酶活性有明显的抑制作用，其他金属离子对酶活性无影响。该酶在甲醇和DMSO中活性可保留69％、61％。重组酶L-7的最适pH为6.0，最适温度为50℃，pH稳定性和温度稳定性均与L-4基本一致，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+(10 mmol/L)对酶活性具有促进作用，在DMSO中活性无损失。 脂类水解酶基因L-4、L-7在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其应用。对两种酶学性质较好的脂类水解酶基因进行优化，构建了野生型(pPICZαA-PL-4、pPICZαA-PL-7)和优化型(pPICZαA-PL-4-opt、pPICZαA-PL-7-opt)4种质粒，经限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化入毕赤酵母X-33。优化后二者酶活分别提高了38.09％,12.16％。对优化后重组酶PL-4-opt，PL-7-opt制备冻干粉，酯酶酶活分别为1.42 U/g、37.85 U/g，脂肪酶酶活分别为85.26U/g、213.16U/g。重组酶PL-4-opt，PL-7-opt预处理天然羽毛底物，促进角蛋白酶K对底物的水解作用，促进率分别为4.32％、19.30％。脂类水解酶降解羽毛表层脂质，提高角蛋白酶水解羽毛角蛋白的效率。