产耐热尿酸氧化酶菌株的筛选、产酶优化与酶学性质研究

• 作 者: 屠晓玮
• 出 处: 浙江工业大学
• 发表日期: 2020年02期
• 关键词: 尿酸 尿酸氧化酶 筛选 产酶条件优化 酶学性质

尿酸氧化酶(Urate oxidase,UOX)在嘌呤代谢路径中起到重要作用,它能够氧化尿酸生成尿囊素,尿囊素在水中的溶解度是尿酸的5-10倍,能够大大降低生物体内尿酸的含量。在大部分生物、微生物中,都有尿酸氧化酶存在,然而人、猿等灵长类等动物的尿酸氧化酶基因在进化过程中发生突变,使机体缺乏有生物活性的尿酸氧化酶基因,而使尿酸成为人体内嘌呤代谢的终产物。然而体内尿酸浓度长期处于过高的水平就会引发人体内高尿酸血症并加剧很多疾病,如痛风、心血管疾病及肾脏疾病等。尿酸氧化酶可以用于临床治疗,肾脏对尿囊素具有高效的排泄能力,从而减少高尿酸血症对人体的损伤以及并发症。尿酸氧化酶还可以利用尿酸氧化酶-过氧化物酶偶联法测定血尿酸含量。但其产酶能力和耐热性仍制约着尿酸氧化酶的广泛使用。本研究的主要内容如下:1.利用液氮冻融法,将细胞冻结后再融化,增加细胞的通透性,建立胞内尿酸氧化酶快速提取方法。相比常用的超声波破碎法每次只能提取一个样品,此方法可以对多个样品进行同时提取。超声波破碎提取时间为30 min,液氮冻融法提取时间为1 min,提取时间大大缩短。且提取量小,符合快速筛选中样品量小的要求。利用尿酸氧化酶-过氧化物酶偶联法测定血尿酸含量进行快速筛选。相比常规方法,该方法通过生成红色醌亚胺的量测定酶活,呈色深浅反映尿酸浓度高低,更为直观。进行相对酶活的一致性验证,证明了快速提取方法和快速检测法对于筛选的有效性,可用于尿酸氧化酶高通量筛选。2.通过透明圈法进行初筛,再利用高通量筛选法筛选出具有耐热性质的尿酸氧化酶。从132株酵母中筛选出产耐热尿酸氧化酶的菌株CU1。再将该菌株作为出发菌,从利用254 nm的紫外线对菌株进行诱变得到菌株CUM09。出发菌株经70℃处理30 min后保留86.01%酶活性,CUM09的菌株经70℃处理30 min后保留88.89%酶活性。该热处理条件下,CUM09产尿酸氧化酶酶活性比原始菌株提高了2.88%。3.对产朊假丝酵母菌株CUM09进行产酶条件优化,通过单因素实验及正交实验,确定最佳产酶条件为发酵温度28℃,pH8.5,接种量为2.5%,以麦芽汁为碳源氮源培养条件下,利用尿酸作为底物,培养16 h产酶量达到最大,酶活为1249.50 U/mL,比初始条件提高了56.58%。4.研究了产朊假丝酵母CUM09尿酸氧化酶的酶学性质,探讨了酶的最适反应温度、酶的最适反应pH、米氏常数K_m值以及酶对温度的热稳定性。其最适温度为40℃,最适pH为8.5,米氏常数K_m值为36.1μmol/L。70℃下保温30 min,酶活力保持80%以上。