【摘 要】
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黑色素是玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）侵入寄主的关键致病因子,其合成途径受转录因子StMR1的调控。StMR1蛋白具有独特的Cys2His2和Zn（Ⅱ）2Cys6双锌指结构域。迄今为止,共有6种植物病原真菌的黑色素合成调控基因被成功克隆,均编码同一类转录因子,转录因子可以与DNA特异结合来行使转录功能。对转录因子DNA结合的特异性表征是解析转录因子调控功能及进化的关键,然
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黑色素是玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）侵入寄主的关键致病因子,其合成途径受转录因子StMR1的调控。StMR1蛋白具有独特的Cys2His2和Zn（Ⅱ）2Cys6双锌指结构域。迄今为止,共有6种植物病原真菌的黑色素合成调控基因被成功克隆,均编码同一类转录因子,转录因子可以与DNA特异结合来行使转录功能。对转录因子DNA结合的特异性表征是解析转录因子调控功能及进化的关键,然而对该类转录因子如何调控DHN黑色素合成和调控的靶位点知之甚少。本研究在前期获得StMR1基因缺失突变体的基础上,首先创制StMR1基因回补菌株,进一步证明StMR1与DHN黑色素合成关系;通过酵母单杂交技术验证StMR1和黑色素合成途径中关键基因间的直接调控关系,MEME预测StMR1特异结合的DNA基序,该结果可为StMR1调控玉米大斑病菌黑色素合成的分子机制研究奠定基础。主要研究结果如下:1.以质粒pBS和3FLAG+6HA-pUC57为骨架,以草铵膦（Bar）为抗性筛选基因,利用同源重组原理,构建了StMR1基因的回复载体,通过原生质体转化的方法在已有的敲除突变体△Stmr1的基础上创制了基因回补菌株C.△Stmr1-1和C.△Stmr1-2。2.对回补菌株C.△Stmr1-1和C.△Stmr1-2的黑色素产生能力和侵染能力进行分析发现,StMR1基因回复后黑色素合成能力较敲除突变体△Stmr1上升了 9-10倍,侵染效能较突变体明显增加。3.采用实时荧光定量PCR技术对黑色素合成途径中关键基因（StPKS、St3HNR、St4HNR、StSCD、StLAC1和StLA C2）的表达情况进行分析发现,与敲除突变体△Stmr1相比,回补菌株C.△Stmr1-1和C.△Stmr1-2中合成酶基因StPKS,还原酶基因St3HNR、St4HNR,脱水酶基因StSCD和漆酶基因StLA C1、StLA C2的表达量均显著增加,其中St3HNR和St4HNR的基因表达量上升了 4-6倍;StSCD上升了 2-3倍;StPKS上升了0.8-1倍;StLA C1和StLAC2均上升了 1-2倍。4.通过酵母单杂交技术分析转录因子StMR1与黑色素合成途径关键基因的互作关系,结果发现,StMR1与StPKS、St3HNR、St4HNR和StLA C2基因的启动子区有结合,而与StSCD、StLA C1的启动子区不结合,表明StMR1通过直接调控黑色素合成酶基因StPKS、St4HNR、St3HNR和StLA C2的表达影响玉米大斑病菌黑色素合成。5.通过MEME在线分析StPKS、St4HNR、St3HNR和SLAC2基因启动子区序列特征,预测到StMR1识别的核心序列可能是CAT（G/T）,酵母单杂交试验初步确定该序列与StMR1结合。6.以与靶基因StPKS结合为例,通过酵母单杂交技术分别验证Cys2His2锌指基序和Zn（Ⅱ）2Cys6锌簇蛋白基序在StMR1调控功能中的作用,结果发现,StPKS-pAbAi只与具有双锌指结构域的AD-StMR 1互作,与仅含单结构域的AD-StMR 1△C2H2、AD-StMR1△C6和缺失双锌指结构域的AD-StMR1△C2H2/C6均不互作,表明双锌指结构域在StMR1基因功能中是必须的。
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