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乳腺癌是一类主要危害妇女健康的恶性肿瘤，其发病率在美国、加拿大及北欧各国位居前列，我国乳腺癌发病率多年来一直呈上升趋势，且发病年龄明显提前。目前，预防和治疗乳腺癌倍受关注，乳腺癌的治疗目前仍以手术为主，辅以放射治疗、化学治疗、内分泌治疗等，其中化学治疗对于乳腺癌手术前的微转移和转移、手术后的扩散和复发，以及丧失手术机会的晚期乳腺癌的控制等具有不可替代的作用。但乳腺癌普遍存在的多药耐受性(Multidrug resistance，MDR)往往使其对化疗药物不敏感而导致化疗失败。因此，解决乳腺癌的多药耐受性是改观化疗及综合治疗效果，提高患者生存率和生存质量的关健问题。
BCRP/ABCG2最早是在抗肿瘤药物诱导的乳腺癌耐药细胞系中克隆，提示其与乳腺肿瘤耐药的形成有着密不可分的关联。目前，对于BCRP/ABCG2在乳腺癌中的表达所涉及的药物耐受谱尚待详尽，本研究拟利用已建立的BCRP/ABCG2体外表达细胞模型，并结合采用灵敏度、准确度更高的荧光定量RT—PCR方法和免疫组织化学法检测出的BCRP/ABCG2表达阳性的乳腺癌组织标本进行药物敏感实验，可望筛选和完善BCRP/ABCG2介导的耐药谱，进一步阐述BCRP/ABCG2与耐受药物的关系和作用机制，为临床以BCRP/ABCG2表达检测结果为评价指标的乳腺癌化疗药物的优化选择提供有价值的资料。
研究肿瘤药物耐受的目的是寻找耐药形成的靶点，筛选特异性的逆转剂，提高人群预防和临床化疗效果，降低药物毒性。BCRP/ABCG2的耐药逆转研究已有一些文献报道，但临床应用的可行性低。因此，到目前为止，尚未发现成熟有效的针对BCRP/ABCG2的逆转乳腺癌多药耐受的方法。
至首次报道RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象以来，虽然多数核酸内切酶复合体(RNA—induced silencing complex，RISC)蛋白成份尚未阐明，但RNAi在不同种属生物细胞内降解mRNA的高效率、高特异性，使之可能成为研究基因的功能与疾病基因治疗的新型生物技术。迄今为止的研究发现构建感染率高、稳定表达的逆病毒表达载体在体内转录表达siRNA最具优势。为了进一步探讨逆转BCRP/ABCG2介导的乳腺癌药物耐受的作用和方法，本研究将以BCRP/ABCG2的ATP结合盒式区域为靶，设计多条表达RNAi的DNA序列并重组构建至逆病毒载体中，经体内外实验开展逆转BCRP/ABCG2表达与功能的RNA干扰研究，不仅将获得高效抑制BCRP/ABCG2功能的靶向ATP结合区的RNA干扰序列，为提高乳腺癌等恶性肿瘤化疗敏感性创立新方法，而且将为恶性肿瘤的基因治疗和基因功能研究开拓新思路。
方法：
1.运用药物敏感性实验(MTT法)来初步筛选对BCRP/ABCG2表达的模型细胞耐受的抗肿瘤药物；运用高效液相色谱法进一步证实。
2.取临床乳腺癌手术切除组织，采用荧光定量RT—PCR方法和免疫组织化学法检测BCRP/ABCG2的表达；取30-40例BCRP/ABCG2表达阳性的乳腺癌手术切除组织，MTT法验证并分析临床肿瘤组织中BCRP/ABCG2的表达与耐受药物的相关关系。
3.利用表达小分子发夹结构RNA的逆病毒重组系统，针对BCRP/ABCG2基因ATP结合盒(ATP—binding cassette，ABC)结构区域，合成3对靶序列并构建3个pLenti6/BCRPsi重组子，即pLenti6/BCRP1i、pLenti6/BCRP2i、pLenti6/BCRP3i，经病毒包装细胞(293FT)获得各pLenti6/BCRPsi逆转录病毒。
4.将含pLenti6/BCRPsi的逆转录病毒感染体外培养的内源性高表达BCRP/ABCG2的人类绒毛膜癌细胞系—JAR细胞，荧光定量RT—PCR、Western blot法及免疫荧光法检测JAR细胞中BCRP/ABCG2表达变化，预期筛选出含干扰效果较好的pLenti6/BCRPsi的逆病毒(V—BCRPi)。
5.采用药物敏感性实验(MTT法)和流式细胞术评价V—BCRPi逆转JAR细胞对药物的耐受效果。
6.将JAR细胞行裸鼠皮下注射接种，培养建立荷JAR细胞瘤的裸鼠；用V—BCRPi行瘤体注射荷瘤裸鼠后，免疫组织化学法、荧光定量RT—PCR和Western blot检测肿瘤组织BCRP/ABCG2的表达；腹腔注射BCRP/ABCG2耐受的药物后，测量瘤体体积和重量变化及原位杂交技术检测瘤组织细胞凋亡状况。
结果：
1.对BCRP/ABCG2可诱导表达的细胞模型经细胞毒性试验(MTT法)分析得出：随着BCRP/ABCG2的表达增高，细胞对5-氟脲嘧啶(5-Fu)、甲氨蝶呤(MTX)、多柔比星(Dox)、吡柔比星(Pir)、依托泊苷(Eto)、米托蒽醌(Mit)等药物的耐药指数增高(P<0.05，n=3)，而对5-Fu的耐药指数由1至高达10.58。其对如紫杉醇(Pac)、顺铂(Cis)、长春碱(Vin)、丝裂霉素(MMC)、长春地辛(VDS)等药物均敏感。结果提示BCRP/ABCG2的表达能介导5-Fu的药物耐受。
2.经高效液相色谱法分析，不同BCRP/ABCG2表达量的细胞其胞内5-Fu浓度与BCRP/ABCG2的表达呈负相关(r=—0.885，P<0.05，n=3)。而BCRP/ABCG2的特异性抑制剂—Ko143能显著提高胞内5-Fu的浓度(P<0.01)。经此功能检测进一步表明BCRP/ABCG2的表达能介导5-Fu的药物耐受。
3.经实时荧光定量RT—PCR和免疫组织化学方法，检测了140例临床乳腺癌手术标本中有47例标本BCRP/ABCG2表达阳性，阳性率达到33％；随后经MTT法检测了47例阳性BCRP/ABCG2表达的乳腺癌标本对5-Fu的敏感性，结果发现不同BCRP/ABCG2表达量的乳腺癌标本对5-Fu的耐受指数从7达到12，具有高度相关性(r2=0.8124，P<0.01)。研究结果不仅进一步证实了在临床肿瘤标本中BCRP/ABCG2能介导5-Fu的耐受，而且能为BCRP/ABCG2表达阳性的临床肿瘤标本化疗方案的优化提供可靠的科学依据。
4.采用逆病毒RNAi表达系统(Block—iT Lentiviral RNAi Expression System)，构建了针对ATP结合区(第六外显子的207位、745位、939位等起始点20个bp)的3个逆病毒pENTER/vector重组子，经序列测定并Blast比较得以证实均获得阳性重组子，再将阳性重组子分别经酶法重组至病毒表达载体pLenti/vector上，获得3个pLenti6/BCRPsi重组子。
5.随后将3个pLenti6/BCRPsi重组子分别经包装细胞(293FT)包装成感染病毒，并利用BCRP/ABCG2内源性高表达的人类绒毛膜癌细胞系(JAR)作为受试感染细胞，经荧光定量RT—PCR、Western blot杂交和免疫荧光细胞染色等进行表达检测，并经流式细胞术和细胞毒性试验(MTT法)等检测pLenti6/BCRPsi重组子逆转JAR细胞对药物的耐受效果，结果表明pLenti6/BCRP3i抑制BCRP/ABCG2的表达效果较好，且pLenti6/BCRP3i不仅能显著提高MIT在JAR细胞内的存留量，显示出其能有效地抑制BCRP/ABCG2的功能，而且能显著提高JAR细胞对耐受药物5-Fu的敏感性(P<0.01)，显示出较好的药物增敏效果，由此，成功地筛选到了干扰BCRP/ABCG2表达与逆转功能效果最好的逆病毒重组子并命名为V—BCRPi。
6.培养JAR细胞并制备成1x106个/ml的单细胞悬液，以0.2ml/只接种于裸鼠右后背皮下10天左右，建立了荷JAR细胞瘤的裸鼠，并经瘤体多点注射重组逆病毒V—BCRPi及腹腔注射10xIC50浓度的5-Fu药物，经观察14天后，经瘤体体积和体重的变化分析、荧光定量RT—PCR、Western blot、免疫组织化学、原位凋亡检测等方法分析，JAR细胞瘤组织中BCRP/ABCG2的表达能被V—BCRPi有效抑制并且V—BCRPi能增强瘤组织细胞对5-Fu药物的敏感性，提高药物诱导瘤细胞促凋亡的效果。
结论：
1.率先研究得出BCRP/ABCG2能介导5-氟尿嘧啶的药物耐受，完善了BCRP/ABCG2介导的耐受药物，为指导与优化临床以BCRP/ABCG2表达检测结果为评价指标的抗乳腺肿瘤化疗药物的优化选择提供有价值的资料。
2.经体内外研究，筛选到了高效抑制BCRP/ABCG2功能的靶向ATP结合区的RNA干扰序列，获得了行使RNAi的逆病毒重组子(V—BCRPi)，创立了一种提高乳腺癌等恶性肿瘤化疗敏感性的新方法，为恶性肿瘤的基因治疗和基因功能研究拓展了新思路。