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目的:胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,其主要治疗方式主要是通过手术治疗,在手术后再联合进行放疗及化疗等多种方式进行综合治疗,但是经过系统治疗后恶性胶质瘤患者平均中位生存期仅有12-18个月。胶质瘤组织主要是通过血管新生和血管形成来维持自身营养供应,但是目前应用抗血管生成的靶向药物治疗胶质瘤的效果并不满意。在1999年对黑色素瘤研究中发现一种不依赖血管而是通过细胞外基质变形为肿瘤供血的形式,即血管生成拟态。这样为针对胶质瘤抗血管生成拟态靶向治疗的研究提供新的目标。RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)伴随着RNA形成与代谢的始终,调控RNA的稳定性,并参与介导RNA转运和翻译等。细胞溶质聚(A)结合蛋白家族成员PABPC5(poly(A)binding protein cytoplasmic 5),PABPC5在线粒体中参与DNA和RNA的代谢过程。PABPC5基因是由至少两个外显子和一个内含子以及不间断的ORF(open reading frame)组成。在卵巢疾病的研究中表明,PABPC5位于与卵巢早衰相关基因的易位断点DX214上,且PABPC5的高表达与卵巢癌患者的不良预后密切相关,目前未见在胶质瘤研究的相关报道。LncRNAs可作为人类转录组中一大类重要的调控分子并且通过多种方式发挥其生物学功能,并在肿瘤发生发展中发挥重要调节作用,包括表观遗传调控、转录调控和转录后调控,同样对胶质瘤的诊断和治疗存在着重要意义。HCG15(HLA complex group 15)位于6p21染色体上,目前HCG15在胶质瘤和血管生成拟态中尚未见报道。SMD(STAU1-mediated mRNA decay)构成了一个重要的转录后调控途径。STAU1介导的mRNA降解途径,是指lncRNAs与靶基因mRNA 3’-UTR通过Alu元件的特异性序列识别与配对,形成与STAU1结合位点(SBS),募集STAU1与之结合,促进靶基因的mRNA与移码增加蛋1(UPF1)结合,特异性加速靶基因mRNA的降解。ZNF331(zinc finger protein 331),该基因编码含有在转录抑制因子中发现的KRAB(Kruppel相关盒)结构域的锌指蛋白。在胃癌细胞中,ZNF331启动子区发生甲基化后失活,失去抑癌基因作用,进而改变胃癌细胞的生长和侵袭能力。在结直肠癌组织中,ZNF331低表达提示患者预后差。目前,ZNF331调节胶质瘤血管生成拟态的研究中未见报道。LAMC2(laminin subunit gamma 2)是一种细胞外基质糖蛋白家族,是基底膜的主要非胶原成分。参与调节多种生物过程,包括细胞粘附、分化、迁移、信号传导、神经突生长和转移。LAMC2通过AKT信号通路促进肺癌细胞的迁移和侵袭能力。LAMC2在胶质瘤细胞U87和U251中高表达,并且与血管拟态的形成相关。LAMC2通过AKT和ERK信号通路在肿瘤血管拟态的形成过程中发挥关键作用。在胶质瘤中,LAMC2可通过ERK或AKT信号通路促进血管生成拟态的形成,增加胶质瘤的恶性程度。暂时未见ZNF331调控LAMC2的转录进而调节胶质瘤血管生成拟态的研究。本研究首先研究PABPC5、HCG15和ZNF331在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中的表达和功能。进一步研究PABPC5、HCG15和ZNF331在调节胶质瘤VM中的作用。旨在为胶质瘤发展提供新依据。研究方法:1.Real-time PCR检测PABPC5、HCG15及ZNF331mRNA表达水平;2.Western blot检测PABPC5、ZNF331、LAMC2蛋白表达水平;3.分别应用PABPC5表达沉默质粒、HCG15表达沉默质粒、ZNF331表达沉默与过表达质粒、STAU1表达沉默质粒和UPF1表达沉默质粒进行稳定转染胶质瘤细胞;4.应用Transwell实验分别检测胶质瘤细胞迁移、侵袭能力;5.胶质瘤细胞的增殖能力通过应用CCK-8实验进行检测;6.胶质瘤细胞血管拟态生成能力通过体外管形成实验进行检测;7.验证HCG15和ZNF331 mRNA是否通过Alu序列靶向结合并且存在相互作用是通过双荧光素酶报告基因系统验证;8.RNA结合蛋白免疫沉淀法实验验证PABPC5与HCG15、HCG15与STAU1、ZNF331 mRNA与STAU1存在结合作用;9.为了验证ZNF331与LAMC2、PABPC5启动子区是否存在结合作用,我们应用了染色质免疫共沉淀实验;10.检测HCG15及ZNF331 mRNA是否存在新生RNA,我们应用了RNA新生实验;11.检测HCG15及ZNF331 mRNA的RNA半衰期的变化,我们应用了半衰期实验;12.为了验证组织血管生成拟态我们应用CD34-PAS免疫组化染色进行检测;13.为了检测胶质瘤的肿瘤细胞成瘤能力及血管拟态生成能力,本研究应用裸鼠移植瘤实验进行研究。结果:1.PABPC5在胶质瘤组织及细胞中高表达,沉默PABPC5显著抑制LAMC2的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成能力。2.HCG15在胶质瘤组织及细胞中高表达,沉默HCG15显著抑制LAMC2的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成能力。3.RNA-IP验证PABPC5与HCG15存在结合作用。沉默PABPC5能缩短HCG15半衰期。沉默PABPC5同时沉默HCG15能显著抑制LAMC2的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成能力。4.ZNF331在胶质瘤组织及细胞中低表达,沉默PABPC5或者沉默HCG15显著升高ZNF331的表达,共同沉默PABPC5和HCG15显著降低ZNF331的表达。沉默STAU1和UPF1能增强ZNF331表达。过表达ZNF331显著降低LAMC2的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管拟态的形成能力。沉默ZNF331能显著增强LAMC2的表达,增强胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管拟态的形成能力。5.双荧光素酶实验验证了HCG15与ZNF331 mRNA通过Alu序列存在靶向结合作用。RNA-IP实验验证了HCG15、ZNF331 mRNA与STAU1存在结合作用。沉默HCG15显著延长ZNF331 mRNA半衰期。沉默STAU1和UPF1显著延长ZNF331 mRNA半衰期。沉默HCG15同时过表达ZNF331显著抑制LAMC2的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成能力。沉默HCG15能够逆转沉默ZNF331后LAMC2的蛋白表达水平的增加,同时能逆转胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成能力。6.ZNF331与LAMC2、PABPC5启动子区结合,抑制其转录。7.沉默PABPC5、沉默HCG15、过表达ZNF331和同时联合沉默PABPC5、HCG15及过表达ZNF331显著抑制裸鼠移植瘤生长,延长其生存期,并且减少胶质瘤血管生成拟态的形成。结论:1.PABPC5、HCG15在胶质瘤组织及U87和U251胶质瘤细胞中高表达,ZNF331低表达,沉默PABPC5、HCG15或者过表达ZNF331能够抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。2.PABPC5与HCG15存在特异性结合作用,PABPC5能够增加HCG15的稳定性。HCG15通过SMD途径,促进ZNF331 mRNA的降解。3.ZNF331与LAMC2和PABPC5的启动子区结合,抑制其转录,从而抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。4.沉默PABPC5能够通过降低HCG15的稳定性,降低其表达;进一步减弱HCG15对ZNF331的mRNA降解作用,增加ZNF331的表达;进而抑制LAMC2和PABPC5转录,从而抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。