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背景与目的:众所周知,脂肪细胞有多种生理功能,包括维持能量平衡和分泌脂肪细胞因子。然而由于能量过多摄入,会导致脂肪细胞肥大和增生,特别是内脏脂肪细胞的肥大和增生,将产生出各种病理反应,包括肥胖,胰岛素抵抗和高血压等代谢综合征。一般认为,脂肪细胞来源于前脂肪细胞,这一过程称为脂肪细胞的分化,即脂肪生成。在脂肪生成中,前脂肪细胞会发生一系列形态与功能的变化,并在适当的环境和基因调控下,前脂肪细胞可以分化成为脂肪细胞。因此,抑制前脂肪细胞的分化可能成为应对肥胖及其相关疾病的治疗策略之一。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶的主要成分,具有广泛的生物活性,包括抗炎、抗氧化、抗感染、抗癌的作用。然而,很少有人知道其抗脂肪活性的发生机制。本研究目的是探讨EGCG对小鼠胚胎成纤维细胞,即前脂肪细胞(3T3-L1细胞)分化的影响并探讨其可能的机制。方法:(1)EGCG对细胞存活率的作用:将前脂肪细胞分为五组,分别加入不同浓度的EGCG(10,50,100,200μM),通过MTT法试验评估EGCG对3T3-L1细胞分化时存活率的影响。(2)EGCG最佳浓度的确定:将3T3-L1细胞分为五组,分别加入不同浓度的EGCG(10,50,100,200μM),通过油红O染色观察EGCG浓度对3T3-L1细胞分化作用的影响。(3)EGCG最佳诱导时间的确定:将3T3-L1细胞在最佳EGCG诱导浓度下分化2,4,6,8天,再用油红O染色观察其脂滴形态,通过免疫印迹分析法(Western blotting),检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸合酶(FAS)的表达。(4)EGCG通过PI3K-AKT信号通路抑制脂肪生成的机制鉴定:实验分为7组,为(1)正常组(Control);(2)DMSO组(Vehicle);(3)EGCG组(100μM);(4)正常+激活剂(10μM SC-3036或0.5μM SC-79)组;(5)EGCG+激活剂(10μM SC-3036或0.5μM SC-79)组;其中SC-3036为PI3K激活剂,SC-79为AKT激活剂,各组细胞在各自条件下诱导8天。随后,通过MTT法测定检查细胞活力,通过油红O染色在光学显微镜下观察细胞形态,最后,通过实时定量PCR(RT-PCR)和Western blotting法检测mRNA和蛋白质水平,包括PPARγ,FAS,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),AKT和磷酸化AKT(p-AKT)。结果:(1)MTT法实验结果显示,在10,50,100μM下,细胞增殖和存活率没有明显的变化,而200μM时,细胞存活率明显下降,提示100μM可能是EGCG最佳作用浓度。(2)油红O染色结果显示,随EGCG浓度的增加,3T3-L1细胞的脂滴日益减少,并且PPARγ和FAS,无论在mRNA和蛋白质水平上,都呈浓度依赖性方式减少,表明3T3-L1细胞分化的抑制作用与EGCG浓度有关,100μM为最佳抑制浓度。(3)随着EGCG处理时间的延长,脂滴在第2天开始减少,一直持续至第8天,而且8天后呈显著性减少,在PPARγ和FAS的表达水平中,也能观察到类似的结果,表明第8天是EGCG最佳诱导时间。(4)采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE),Western blotting法检测各组PPARγ,FAS,PI3K,p-AKT蛋白水平,我们发现EGCG成剂量和时间依赖性降低PPARγ与FAS的表达。随后,我们试图观察EGCG对PI3K-AKT信号通路在3T3-L1细胞细胞分化过程中表达的影响,PI3K和p-AKT的表达水平呈剂量依赖性降低,而AKT的表达水平是不明显的,所以我们可以得出EGCG抑制3T3-L1细胞分化是通过抑制AKT的活化而不是AKT的表达来实现的。另有结果显示,在DMSO组内,与control组相比较,+EGCG组的PPARγ,FAS,PI3K,p-AKT表达降低。与+EGCG组相比较,EGCG+SC3036组的PPARγ,FAS,PI3K,p-AKT表达增加,EGCG+SC79组的PPARγ,FAS,p-AKT表达增加。EGCG对3T3-L1细胞分化的抑制作用能被SC-3036或SC-79逆转,表明EGCG下调FAS和PPARγ表达水平来抑制3T3-L1细胞的分化是由PI3K-AKT信号通路介导的。结论:(1)EGCG呈浓度和时间依赖方式抑制3T3-L1细胞的分化;(2)其机制是EGCG抑制PI3K-AKT信号通路介导的PPARγ和FAS的表达。该研究结果将为肥胖患者提供了一种新的预防和治疗方案。