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蓝光作为一种信号分子,既调节植物光形态建成,也调控植物的生长运动反应包括植物的向光弯曲运动,植物叶片的伸展,叶绿体的避光运动,气孔的开闭及下胚轴的生长等。其中植物的向光性可以有效保证植物生长的最佳取向,是植物提高光捕获和躲避强光伤害的重要调节方式。因此,筛选植物向光性应答中的信号元件对进一步探究植物向光性应答中的信号转导机制具有重大意义。植物的向光性反应涉及到多个光受体,蓝光诱导的植物的向光反应主要由向光素及隐花色素介导,拟南芥中向光素有PHOT1(Phototropin 1)和PHOT2(Phototropin 2)两个成员,二者在介导蓝光引起的植物的下胚轴的向光弯曲反应中存在功能冗余,其中PHOT1可以介导较宽范围的蓝光诱导的拟南芥下胚轴的向光弯曲反应,而PHOT2仅介导强蓝光诱导的下胚轴的向光弯曲反应,并与PHOT1表现出功能冗余。课题组前期,为了避开PHOT1的干扰,解析PHOT2调控的强蓝光诱导的拟南芥下胚轴的向光弯曲反应机制,通过突变体筛选获得了PHOT1基因突变基础上的向强蓝光不敏感突变体p2sa1(Phototropin 2 Signaling Associated 1),并证实P2SA1作为向光素的下游信号分子,参与强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲反应,但其具体机制并不是十分清楚。为进一步解析P2SA1介导的向蓝光弯曲反应机制,我们前期以p2sa1的T-DNA插入缺失突变体为材料,诱变获得了p2sa1恢复向强蓝光弯曲且能够稳定遗传的单基因隐性突变体M120,并对M120进行了图位克隆,粗定位结果显示其目的基因定位于2号染色体的中上端,结合M120全基因组高通量测序结果,挑选出AT2G04360、T2G04740、AT2G05520、AT2G05830和AT2G07170共5个候选基因,并订购了相关的突变体种子。为了精细定位M120的图位克隆区间,我们进一步扩大M120的图位克隆群体,做了更精细的定位,通过实验将细定位区间缩小至5.57M～5.79M之间。此外借助Mutmap重测序技术对M120做了回交测序。结合M120的细定位结果,回交测序结果及相关文献报道,铆定了AT2G13600、AT2G12935、AT4G29130、AT5G65440、AT5G65490和AT5G63860共6个候选基因,经克隆其基因测序验证均发生了外显子突变,并订购了其对应的突变体种子。我们对订购的候选突变体种子进行了纯合体鉴定,共获得12种纯合材料。我们对纯合突变体进行了强蓝光下的下胚轴向光弯曲表型鉴定,发现其在强蓝光下均能够发生下胚轴向光弯曲。随后,我们将12种纯合突变体分别与p2sa1突变体进行杂交构建双突变体。目前已鉴定得到9种双突纯合材料,经表型验证其中7双突突变体未能恢复p2sa1的向光弯曲,另外2种双突突变体恢复了p2sa1的向光弯曲表型,对其表型还需要进一步的验证。此外,我们构建了 P2SA1基因的Cas9载体,将其侵染候选基因突变体,通过基因敲除的方法构建双突材料,已拿到6个基因的T2代转基因材料。同时,构建了相关候选基因的超表达载体,通过农杆菌介导的转基因技术侵染M120以期能够拿到恢复M120相关表型的基因,目前已拿到5个基因的T1代转基因材料。通过上述工作的开展,以期鉴定到p2sa1突变体的抑制子。通过对EMS诱变的T-DNA插入的p2sa1的M2代约20000棵突变体种子继续进行筛选,共得到3个稳定遗传的且能够恢复p2sa1黄化苗下胚轴向强蓝光弯曲的突变体M2-10、M2-22、M2-43及一株下胚轴较短的突变体M2-7。遗传分析显示,M2-7为单基因隐性突变。我们构建了 2500个M2-7的图位克隆群体,通过粗细定位分析,将M2-7定位于2号染色体的中上端。回交测序结果显示M2-7突变体中的GA(Gibbere1linA)受体GID1的合成基因AT3G05120的第859位的G突变为A,造成其第286位的甘氨酸突变为丝氨酸。为了验证AT3G05120基因突变造成M2-7胚轴发育缺陷,我们分别用不同浓度的GA3,独脚金内酯GR24(Strigolactone analog)处理M2-7,发现M2-7下胚轴在添加GR24时有所伸长,在添加GA3处理后却没有变化,证明M2-7突变后不能正常利用GA3的表型是具有特异性的,推测M2-7胚轴伸长发育缺陷的表型可能是由于GA代谢信号通路异常引起的。为此我们订购了 M2-7的候选突变体种子,并构建了AT3G05120基因的回补载体,以待后续对基因进行功能回补验证。此外,光能够抑制胚轴的伸长,我们分别用不同的光质及去糖处理M2-7,发现M2-7能够正常响应不同光质,胚轴伸长受到不同程度的抑制;响应去糖处理胚轴恢复部分伸长,证明M2-7胚轴伸长发育缺陷的表型并非是通过影响光信号转导通路导致的。结合以上实验分析,我们认为M2-7胚轴伸长发育缺陷的表型很可能是由于AT3G05120基因的的突变引起的。