论文部分内容阅读
类黄酮是植物次生代谢中的重要因子，具有抗氧化、清除氧自由基、吸收紫外线和抗重金属胁迫的作用。同时，类黄酮还在促进人类健康方面具有重要的意义。植物中类黄酮复杂的生物学功能是由其结构多样性决定，类黄酮相关的尿嘧啶二磷酸葡萄糖糖基转移酶(UDP-glucose:flavonoid glucosyltransferases，UFGTs)催化了类黄酮的糖基化，是其结构多样性的基础。豆科植物含有丰富营养物质，还可产生以类黄酮为主的多种次生代谢产物。类黄酮合成途径机理的阐明将为豆科植物附加值提升奠定理论基础，UFGTs的鉴定和功能分析将是一个突破口，虽然现在已有很多关于UFGTs的报道，但豆科植物中UFGTs的体内功能仍有很多不清楚。本论文主要以豆科植物——百脉根和大豆为对象，鉴定和功能分析其中的UFGTs，为品种改良和其中类黄酮的利用提供理论基础。 本研究从百脉根基因组和转录组数据库中，通过生物信息学分析，整理得到71个全长的LjUGTs。利用LjUGTs与AtUGTs氨基酸序列构建进化树分析，发现LjUGTs72家族的12个LjUGTs聚类于类黄酮相关的E进化组。12个LjUFGTs重组蛋白中UGT72AD1、UGT72AF1、UGT72AH1、UGT72V3和UGT72Z2能催化黄酮醇、黄酮和异黄酮的糖基化，其中UGT72AD1、UGT72AH1和UGT72Z2能特异地催化黄酮醇的糖基化。UGT72AD1、UGT72AH1和UGT72Z2在种子中高表达，表明它们可能参与了种子中黄酮醇糖苷的积累。 UGT72AD1和UGT72Z2在百脉根毛状根中可以促进山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷的积累，转基因毛状根比对照增加18.92％以上，表明UGT72AD1和UGT72Z2在毛状根中催化了黄酮醇的糖基化。同时，我们在转基因拟南芥中，发现UGT72AD1和UGT72Z2能够促使幼苗中富集山奈酚-3-O-鼠李糖-7-O-鼠李糖苷，并发现转基因幼苗根的生长受到一定程度的抑制，这说明幼苗中黄酮醇糖苷的积累可能抑制了根中生长素的运输。 本研究借助大豆基因组和转录组数据库，经多重筛选，从182个GmUGTs中获得14个GmUFGTs候选基因。进化树分析发现它们主要分布于具有底物多样性的进化组，表明它们可能具有类似的催化特性。其中9个GmUFGTs重组蛋白都可以催化黄酮醇的糖基化，UGT73C19、UGT73C20和UGT88E19对异黄酮具有体外催化活性，UGT88A13对表儿茶素具有活性，其余5个GmUFGTs则是特异地催化黄酮醇的糖基化。9个Gm UFGTs的组织表达谱表明，这些GmUFGTs具有组织表达特异性，大豆不同的组织中类黄酮糖苷的积累可能是由不同的GmUFGTs起作用的。 转基因UGT72Z3、UGT73C19、UGT73C20、UGT88E19和UGT92G4大豆毛状根中异黄酮总量显著高于对照，其中黄豆苷元糖苷(Dai-1)都显著增加。转基因GmUFGTs大豆毛状根中的总黄酮醇糖苷水平显著高于对照3倍以上（除UGT72Z3）。同时，与野生型Col相比，转基因UGT72X2、UGT72X4、UGT88A13和UGT92G4拟南芥幼苗的三种山奈酚糖苷和总黄酮醇糖苷都显著提高。而转基因UGT72X4、UGT73C19、UGT73 C20和UGT92G4种子中总黄酮醇糖苷都显著提高，其中槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量是野生型的3倍以上。转基因UGT88A13拟南芥种子中可提取的PAs含量比野生型显著升高，而不可提取的PAs含量显著降低。上述结果表明，植物中GmUFGTs的功能既有相似性，也有特异性。 本研究利用植物中已解析的UGTs晶体结构模拟目标UFGTs的蛋白结构，并结合分子对接工具预测目标UFGTs中底物特异性相关的关键位点和区端。F148可能是UGT73C19与底物结合的活性位点，通过突变实验发现突变蛋白F148A对黄酮、黄酮醇和异黄酮糖基化催化活性比UGT73C19重组蛋白显著降低，尤其是对山奈酚的活性仅为UGT73C19的1/7;Ⅰ13和249-254位氨基酸是UGT88A13与底物结合的活性位点和区段，突变蛋白Ⅰ13R和A249-254对表儿茶素和黄酮醇糖基化催化活性显著降低于UGT88A13，其中A249-254对于表儿茶素的糖基化催化活性仅为UGT88A13的1/3。上述结果表明UGTs与底物结合时，蛋白结构中N端附近(N1环)氨基酸和中间连接区段起到非常重要的作用。 综上，本研究阐述了百脉根和大豆中类黄酮的糖基化修饰，通过分子同源建模预测并实验验证了UFGTs中对于催化糖基化反应的关键活性位点与区段。本研究为豆科植物品种改良和类黄酮的利用奠定了理论基础。