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microRNAs(miRNAs)是近几年分子生物学的研究热点。它是一类长度约为19-25个核苷酸的单链非编码小分子RNA,并通过降解mRNA分子或抑制mRNA翻译来调控转录后基因表达的过程。miRNAs已经被证实在很多生物学过程中起重要作用,而且越来越多的研究表明miRNAs还参与调控病毒在宿主细胞内的感染和复制过程,但miRNAs是否参与流感病毒在宿主细胞内的复制还没有相关报道。本文就这一问题进行了研究。
首先我们利用3’-UTR报告系统来筛选可能成为miRNA作用靶点的病毒基因。即在pRL-TK载体中luciferase基因的3’-UTR端插入流感病毒基因,并检测插入的病毒基因片段对报告基因表达水平的影响。实验结果表明,插入pb1基因可以使报告基因的表达水平下降3倍左右。这一结果暗示,pb1基因中可能存在潜在的miRNA作用靶点。为了进一步缩小筛选范围,将pb1基因截断成5段,每段500bp左右。再次利用3’UTR报告系统筛选,研究结果表明pb1-5(1815bp-2341bp)片段可以使luciferase基因的表达水平下降3倍左右,根据上述实验结果,推测pb1-5可能是miRNAs的潜在作用靶点。
随后我们利用MicroInspector预测可能作用于pb1-5基因片段的miRNAs,并用RNAHybrid和ma22验证预测结果,最终获得12条可能作用于pb1基因的miRNAs。构建这些miRNAs的高效表达载体,并检测这些miRNAs对pGL-TK-pb1-5基因表达水平的影响,结果显示miR-323、miR-654、miR-639、miR-591、miR-608、miR-601、miR-26a、miR-509、miR-939、miR-491均可在不同程度上下调pRL-TK-pb1-5上luciferase基因的表达。
随后我们分别利用血凝值(HA)检测、免疫荧光标记以及real-timePCR技术检测了这些miRNAs对H1N1型流感病毒在MDCK细胞内复制的影响。研究结果表明miR-323、miR-491、miR-654、miR-26a和miR-939均可调控流感病毒的复制过程(miR-323、miR-491和miR-654在另外的研究中报道)。其中miR-323、miR-491、miR-654和miR-26a可以下调流感病毒的复制,而miR-939则可以上调流感病毒的复制。其中miR-26a和miR-939对流感病毒复制的调控机制尚有待于进一步深入研究。