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目的脑挫伤(brain contusion)是一种常见的原发性脑损伤,指由于外力作用形成的软脑膜完整而脑皮质浅层出血和(或)挫碎。其症状通常表现为不同程度的意识障碍,严重者可致死亡。神经干细胞是指存在于神经系统中,具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,并能自我更新的细胞。Nestin(neuroepithelial stem cell protein)是一种胚胎时期表达的第Ⅵ类中间丝蛋白,为神经干细胞特征性的生物学标记物。多项动物实验发现,在机械性脑损伤、脑缺血及兴奋性毒性脑损伤等应激刺激下,神经细胞可出现胚胎期的逆转,特异性及一过性表达nestin蛋白,nestin表达明显上调并呈现一定时空变化规律。HSP 70是热休克基因家族中在进化上最保守、最主要的一类应激蛋白,主要功能是维持细胞蛋白自稳,提高细胞对应激原的耐受性,使细胞维持正常的生理功能。正常情况下,脑组织内HSP 70含量极少,一般位于细胞浆内,但在高温及各种应激状态下,细胞核内HSP 70表达迅速增加;细胞处于恢复阶段,细胞核内HSP 70消失,细胞浆内仍有低水平HSP 70表达。在神经系统受损后早期即可诱导HSP 70基因转录,多项研究表明它是神经损伤的一种早期指标。本研究通过复制大鼠脑挫伤模型,应用免疫组织化学染色方法,观察大鼠脑挫伤后不同时间内nestin/HSP 70蛋白表达与脑挫伤经过时间的关系,探讨nestin是否可作为法医学推断早期脑损伤时间的敏感指标之一。方法将46只健康雄性SD大鼠完全随机分成正常对照组、假性损伤组、死后损伤组及脑损伤组。损伤组又按损伤后处死时间不同,分为0.5h、6h、12h、1d、3d、7d、14d及28d组。利用改造的Edward自由落体装置,撞击大鼠制造脑挫伤模型,脑组织常规取材后,在HE染色观察的基础上,应用免疫组织化学方法,观察不同时间nestin及HSP 70染色变化。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统,测量损伤侧顶叶皮层(挫伤灶周围)、海马齿状回及胼胝体区nestin阳性细胞平均光密度值;测量损伤侧顶叶皮层(即挫伤灶周围)HSP 70阳性细胞平均光密度值,并对所获得的实验数据,采用SPSS for Windows 12.0统计学软件包进行处理,统计方法为单因素方差分析。结果HE染色结果观察,损伤组可见挫伤局部蛛网膜下腔出血,大脑皮层内有多个大小不一、散在的出血灶,有的伴有脑组织挫碎,脑组织轻度水肿。在脑损伤早期(<1d),大脑皮质及海马内可见以神经元细胞肿胀、变性、坏死为主要病理改变。脑损伤晚期(>3d)组,脑组织内坏死神经元增多,呈灶状,胶质细胞反应性增生。对照组末见明显改变;假性损伤组仅见脑组织轻度淤血、水肿;死后损伤组见少量蛛网膜下腔出血。(1) nestin免疫组织化学染色观察,对照组大鼠脑组织中nestin阳性反应主要存在于侧脑室的室管膜下区及海马齿状回颗粒下层。在大鼠脑挫伤组,伤后0.5h～1d,挫伤灶周围阳性细胞逐渐增加,细胞染色加深,以圆形、椭圆形和锥体形为主,并围绕挫伤灶分布。3d～7d,挫伤灶周围阳性细胞逐渐增加到最多,nestin阳性细胞明显呈“星状”:一部分细胞胞体肥大,突起多而粗大,排列紧密,交织成网状结构,主要围绕在挫伤灶的周边,染色深,另一部分细胞胞体较小,突起细而少,排列稀疏,主要分布在离挫伤灶较远的区域。14d～28d,nestin阳性细胞染色显著变淡,在上述区域分布明显减少。伤后0.5h～1d,海马齿状回颗粒下层阳性细胞逐渐增加,细胞染色加深,以椭圆形和锥体形为主。3d～7d,nestin阳性细胞逐渐增加到最多,细胞呈“星状”,分布于海马齿状回颗粒下层、颗粒层及门区。14d～28d,nestin阳性细胞染色显著变淡,在上述区域分布明显减少。伤后0.5h～1d,胼胝体区nestin阳性细胞逐渐增加,细胞染色加深,以圆形、椭圆形和锥体形为主,细胞长轴方向与胼胝体神经纤维束走向一致。3d～7d,nestin阳性细胞逐渐增加到最多,细胞呈“星状”,细胞长轴方向与神经纤维束走向一致。14d～28d,nestin阳性细胞染色显著变淡,分布明显减少。(2) HSP 70免疫组织化学染色观察,阳性细胞主要为神经元及毛细血管内皮细胞。对照组脑组织中仅见小血管及微血管内皮、室管膜及脉络膜上皮细胞有低水平HSP 70表达,皮质内未见表达。在大鼠脑挫伤组,伤后0.5h在挫伤灶周围可见少量HSP 70阳性细胞,仅胞浆着色,突起小,染色较淡;6h～12h阳性细胞表达逐渐增加到最强,胞核及胞浆均着色,突起粗大,染色深;24h组阳性细胞数目明显减少,胞浆着色明显变浅,基本恢复至正常组表达水平;3d～7d阳性细胞表达又再次升高,胞浆及胞核均着色,染色变深;14d～28d组HSP 70阳性细胞逐渐恢复到正常组表达水平。结论本研究利用改造的Edward自由落体装置,撞击制造大鼠脑挫伤模型,在HE染色的基础上,对大鼠脑组织进行病理学观察,发现损伤组脑组织镜下符合脑挫伤的组织病理形态学改变,脑挫伤模型制作成功。Nestin/HSP 70免疫组织化学染色观察,nestin在神经细胞中表达具有特异性,对照组仅见少量nestin/HSP 70免疫组织化学染色阳性细胞表达,且表达部位局限,损伤早期即可见nestin/HSP 70蛋白表达,表达强度与损伤经过时间之间密切相关,表达持续时间较长,并呈现一定时空规律性。Nestin和HSP 70两项免疫组织化学指标研究中,均有阳性物质出现、高峰和下降的过程,并且此过程与损伤经过时间密切相关,因此把两项或者更多指标结合起来进行检测研究,联合判断、综合分析,对于脑挫伤早期及较长时段损伤时间判断,具有更大价值,也将使脑损伤时间推断更具科学性和准确性。Nestin和HSP 70可作为推断早期脑损伤的敏感性指标,同时也可作为鉴别生前和死后脑损伤的重要标志。Nestin可作为法医病理学推断早期脑损伤时间的敏感性指标之一。