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目的:本课题旨在建立小鼠后足癌痛模型的基础上,从β-END的表达初步探讨华蟾素治疗癌痛的外周机制。 方法:1、小鼠后足癌痛模型的制作:选择22只雌性昆明小鼠,向右后足足底注射H22肝癌细胞悬液,同时向左后足足底注射生理盐水作为对照,每只小鼠的右足和左足在造模前、造模后第2、4、6、8、10、12、20、30天分别进行后足痛行为和足肿胀测定,并按照一定时间颈椎脱臼处死小鼠取其右足做HE染色,进行形态学观察。 2、华蟾素治疗癌痛模型小鼠的外周机制:将60只雌性昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、华蟾素组、华蟾素联合NAL-M组和吗啡组,每组12只。除正常组的小鼠的右后足注射生理盐水外,其余各小鼠的右后足足底均注射H22肝癌细胞悬液。从造模第9天开始给药,正常对照组腹腔注射生理盐水,后足癌痛模型组分别用生理盐水联合生理盐水腹腔注射、华蟾素注射液联合生理盐水、华蟾素注射液联合外周阿片受体拮抗剂NAL-M和吗啡联合生理盐水,连用8天;各组小鼠在造模前、造模后第2、4、6、8天以及给药第2、4、6、8天分别进行后足痛行为测定。给药的最后一天称取体重、痛行为测定结束后,处死动物,取标本检测。取脾和胸腺并称重,计算脾和胸腺指数。按组织切片要求留取右后足肿瘤及周围组织标本;用ELISA法测定右后足肿瘤及周围组织匀浆液和血浆中β-END、CRF、IL-1β的含量;免疫组化法检测右后足肿瘤及周围组织中β-END、POMC和μ-阿片受体的表达。 结果:1、小鼠后足癌痛模型的制作结果:与左后足比较,右后足既表现了热痛觉过敏,又表现出了机械性痛觉过敏,同时还出现了“镜像痛”现象。后足的形态学观察发现,右后足癌细胞最终侵润到骨。 2、痛行为测定结果:与正常对照组比较,模型组右后足在造模后的第4天既表现了热痛觉过敏(p<0.01),又表现出了机械性痛觉过敏(p<0.01)。华蟾素可显著改善癌痛小鼠的痛行为,显著的提高模型鼠的热痛觉阈值和机械性痛阈值(p<0.05或p<0.01),但没有吗啡的起效作用快而强。而外周阿片受体拮抗剂NAL-M能够消除华蟾素的镇痛作用。 3、脾和胸腺指数测定结果:与正常对照组比较,模型组的脾和胸腺指数显著地降低(p<0.05或p<0.01)。华蟾素可显著提高癌痛小鼠脾和胸腺指数(p<0.05或p<0.01)。 4、右后足肿瘤及周围组织匀浆和血浆中β-END、CRF、IL-1β的含量测定结果:与正常对照组比较,模型组肿瘤及周围组织匀浆中的CRF、IL-1β的含量可显著增高(p<0.05或p<0.01)。相比之下,β-END的含量则显著降低(p<0.05或p<0.01)。华蟾素可显著提高肿瘤及周围组织匀浆中的β-END、CRF的含量(p<0.05或p<0.01),而对血浆中β-END、CRF、肿瘤及周围组织匀浆和血浆中的IL-1β的含量影响较小。 5、右后足肿瘤及周围组织中β-END、POMC和μ-阿片受体的表达结果:免疫组化结果显示,正常对照组中的小鼠足组织中β-END、POMC和μ-阿片受体的表达均较高,而癌痛模型小鼠的足肿瘤及周围组织中的β-END、POMC和μ-阿片受体的表达显著下降,且与正常组比较,具有显著统计学意义(p<0.01)。而华蟾素则可显著地提高癌痛小鼠肿瘤及周围组织中β-END、POMC和μ-阿片受体的表达,且与模型组比较,具有统计学意义(p<0.01)。 结论:1、本实验制备的癌痛模型既表现了热痛觉过敏,又表现出了机械性痛觉过敏,同时还出现了“镜像痛”现象。后足的形态学观察发现,右后足癌细胞最终侵润到骨,说明该癌痛模型制备较为成功,可作为研究治疗癌痛药物的模型。 2、华蟾素能够改善癌痛模型小鼠的症状,显著提高癌痛小鼠的痛阈值,其机制可能与增加肿瘤及周围组织中β-END的含量有关,具体如下:可提高癌痛小鼠的脾和胸腺指数,增强癌痛小鼠的免疫功能;可提高癌痛小鼠足肿瘤及周围组织中POMC的表达、CRF的含量,增加β-END的合成以及释放,从而增加肿瘤及周围组织中β-END的含量;可增加肿瘤及周围组织中μ-阿片受体的表达,最终增加β-END与μ-阿片受体在肿瘤及周围组织中的结合机会,发挥外周镇痛作用。