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脐血中含有丰富的造血干细胞,可以治疗恶性血液病和免疫系统疾病,是继骨髓和外周血之后新近发现的造血干细胞的又一来源。目前在临床上已经广泛替代骨髓成为造血干细胞移植的重要来源。为了更有效地利用脐血造血干细胞,脐血和脐血造血干细胞的低温保存技术便成为一个重要的课题。目前国际上,低温保存脐血主要采用的是慢速冻存,但是这种方法的冻存效果以及冻存技术还有需要提高和完善的问题;玻璃化法作为一种新型的,简便的冷冻保存方法可以有效地克服慢速冻存的缺点,但是玻璃化法需要高浓度的保护剂才能实现,这会给造血干细胞带来很大的渗透损伤和毒性损伤。本文对脐血造血干细胞的低温保存过程中的降温方案、冷冻保护剂的导入和导出程序以及玻璃化溶液的凝固特性等方面的问题进行了较为系统的研究。 首先对造血干细胞的慢速冻存进行了研究。通过实验对慢速冻存造血干细胞过程中,DMSO溶液的最佳浓度、导入过程和慢速降温时的最佳降温速率进行了研究并分析。同时,对几种慢速冻存保护剂的保护效果进行了比较和优选。实验结果表明,慢速冻存造血干细胞过程中,1℃/min的降温速率和10%浓度的DMSO会取得最佳的冻存效果,在几种慢速冻存保护剂优选中,应用XX3号保护剂,冷冻造血干细胞的活率可以达到85%,有比较好的保护效果。 其次,对造血干细胞玻璃化保护剂进行了研究。首先对多种保护剂对溶液凝固的抑制效果进行了分析比较并对保护机理进行了探讨,然后对三种合适的渗透性保护剂对造血干细胞的保护效果进行了全面的比较,最后以DMSO为联合玻璃化保护剂的基础成分,通过多种保护剂的联合配制,找出最适合造血干细胞的联合保护剂的配方。最终确定联合玻璃化保护剂为:25%DMSO、17%甲酰胺、10%1,2-丙二醇和6%聚乙二醇(w/v)。 最后,研究了所配制的玻璃化保护剂导入造血干细胞悬液的步骤和操作温度对细胞活率的影响。实验温度分别选择了室温(17-19℃),冰水混合物(0-4℃)和更低的温度(-9—11℃)下进行。同时,对造血干细胞的玻璃化冻存和慢速冻存进行了比较分析,并对玻璃化保护剂洗脱过程中操作温度的影响以及一步快速导出,不同时间的逐步导出和在洗脱液中添加不同浓度的蔗糖溶液对洗脱效果的影响进行了分析。实验结果表明在玻璃化保护剂导入过程中,降低操作温度可以有效地提高造血干细胞的活率,而对于低浓度保护剂的导入,结果却正好相反。在对造血干细胞进行玻璃化冻存和慢速冻存的比较实验中,在不洗脱保护剂的前提下,两种方法取得了基本一致的保护效果。在保护剂导出实验中,低的操作温度不利于保护剂的导出,而相对于分步导出程序,一步法快速导出对细胞的稀释洗脱是不利的,但逐步稀释导出的时间不宜过长,同时,脐血造血干细胞低温保存过程的研究在洗脱液中添加0.75mol/l的蔗糖溶液对洗脱效果是有很大帮助的。关键词:造血干细胞;玻璃化;导入和洗脱;冷冻保护剂;冷冻