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化疗是恶性肿瘤患者常用的治疗方法，但化疗药物对肠黏膜的损伤导致肠黏膜屏障功能障碍及肠道细菌易位。许多实验对细菌易位进行了研究，然而，常规的细菌培养技术并不能证明所培养出的的细菌真正是来源于肠道内的菌群。为了证明肠道内的细菌能够易位到肠道外组织，一些研究者使用放射性同位素及荧光素标记细菌对细菌易位进行示踪。然而，由于放射性同位素和荧光素标记方法的稳定性较差，标记物可能会从细菌中分离丢失，影响结果的准确性。
为了明确从肠道外组织分离出来的细菌是否来源于肠道，就必须选择一种稳定、可靠的细菌标记物。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是从太平洋水母等腔肠动物中分离出来的天然荧光蛋白，在蓝光或近紫外光的照射下，不需加入任何反应底物或酶即可发射绿色荧光，且荧光性质十分稳定，无光漂白现象发生。GFP已成为一种监测体内基因表达及细胞内蛋白定位、示踪完整活细胞生命现象的重要报告基因，在生物医学领域的应用日益广泛。
本研究首先建立示踪肠道细菌易位的绿色荧光蛋白标记技术，利用这一技术对肠道细菌易位进行示踪；并探讨肠黏膜屏障功能检测方法及重组人粒细胞集落刺激因子(recombina．tion human granulocyte colony—stimulating factor，rhG—CSF)对化疗导致的肠黏膜屏损伤的保护作用。
第一部分示踪细菌易位的绿色荧光蛋白标记技术的建立
目的：建立证明肠道细菌易位的绿色荧光蛋白标记技术。
方法：将40只雄性SD大鼠随机分为3组：正常组(n=10)、对照组(n=10)、MTX组(甲氨蝶呤组，n=20)。对照组、MTX组大鼠灌饲绿色荧光蛋白(GFP)标记的大肠杆菌(Escherichia coli)TG─1(10ml/kg体重，每日一次，连2天)对易位的细菌进行示踪；MTX组大鼠模型制作方法：皮下注射甲氨蝶呤(MTX，3.5mg/kg体重，皮下注射，每日一次，连续给药3天)以导致大鼠肠黏膜屏障损伤；正常组、对照组大鼠用0.5ml生理盐水皮下注射，每日一次，连续给药3天。检测指标：使用荧光显微镜及质粒酶切电泳鉴定内脏及血液培养出的细菌是否来源于肠道；PCR检测MTX组大鼠血液内大多数细菌所共有的16SrRNA基因及大肠杆菌特异性的β-半乳糖苷酶基因。
结果：在正常组、对照组内脏及血液标本中均未培养出细菌；在MTX组大鼠的肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏、血液中培养出GFP标记的Escherichia coliTG-1；大鼠血液中检测出16SrRNA基因及β-半乳糖苷酶基因。
结论：GFP标记技术检测肠道细菌易位稳定、可靠、简单；当化疗导致肠黏膜屏障损伤时，存在细菌易位现象；PCR技术证实了易位的细菌与肠道内的细菌具有同源性，因而也证实了GFP示踪技术的准确性和可靠性。
第二部分肠黏膜通透性检测方法比较
目的：探讨肠黏膜通透性的检测方法。
方法：30只雄性SD大鼠随机分为3组：正常组(n=10)、对照组(n=10)、MTX组(甲氨蝶呤组，n=10)。对照组、MTX组大鼠灌饲绿色荧光蛋白(GFP)标记的大肠杆菌(Escherichia coli)TG-1(10ml/kg体重，每日一次，连2天)对易位的细菌进行示踪；MTX组大鼠皮下注射甲氨蝶呤(MTX)制作大鼠肠黏膜屏障损伤模型，模型制作方法同第一部分。检测指标：大鼠尿乳果糖/甘露醇(L/M)比值、血浆D—乳酸水平、小肠组织和血浆二胺氧化酶(DAO)活性、小肠黏膜病理形态，使用荧光显微镜及质粒酶切电泳鉴定内脏及血液分离出的细菌是否来源于肠道。 结果： MTX组大鼠尿L/M比值、血浆D-乳酸水平、血浆DAO活性均显著高于正常组及对照组；MTX组小肠组织DAO活性、空肠黏膜厚度、空肠绒毛高度、回肠黏膜厚度、回肠绒毛高度均显著低于正常组及对照组组；在正常组、对照组内脏组织及血液标本中均未培养出细菌；在MTX组大鼠的肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏、血液中培养出GFP标记的Escherichia coli TG-1；空、回肠黏膜厚度及绒毛高度与细菌易位率呈显著负Spearman等级相关、与细菌易位量呈显著负线性相关；尿L/M比值、血浆D—乳酸、血浆DAO与细菌易位率呈显著正Spearman等级相关、与细菌易位量呈显著正线性相关。
结论：尿L/M比值、血浆D—乳酸水平、血浆DAO是检测肠黏膜通透性及肠黏膜屏障损伤的有效方法；细菌易位与肠黏膜通透性及肠黏膜屏障损伤密切相关。
第三部分rhG—CSF对化疗导致肠黏膜屏障损伤的保护
目的：探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG—CSF)对化疗导致的肠黏膜屏障损伤的保护作用。
方法：将30只雄性SD大鼠随机分为3组：对照组(n=10)、MTX组(n=10)、G—CSF组(n=10)。MTX组、G—CSF组大鼠灌饲绿色荧光蛋白(GFP)标记的大肠杆菌(Escherichia coli，)TG-1(10ml/kg体重，每日一次，连2天)对易位的细菌进行示踪；MTX组、G—CSF组大鼠皮下注射甲氨蝶呤(MTX)制作大鼠化疗模型，模型制作方法同第一部分；G—CSF组大鼠皮下注射rhG—CSF(惠尔血，日本麒麟公司)10μg/kg体重，每同一次，连续4天。检测指标：大鼠体重、摄食量、尿L/M比值、血浆D—乳酸水平、小肠组织和血浆DAO活性、小肠黏膜病理形态及易位细菌的检测。
结果：MTX组大鼠尿L/M比值、血浆D—乳酸水平、血浆DAO活性均显著高于对照组；MTX组大鼠小肠组织DAO活性、小肠黏膜厚度及绒毛高度均显著低于对照组；G—CSF组L/M比值、血浆D—乳酸水平、血浆DAO活性均显著低于MTX组；G—CSF组小肠组织DAO活性、小肠黏膜厚度及绒毛高度均显著高于MTX组；在对照组内脏组织及血液标本中均未培养出细菌；在MTX组、G—CSF组大鼠的肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏、血液中培养出GFP标记的Escherichiacoli TG-1，但G—CSF组大鼠的肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏、血液的细菌易位率、细菌易位量均显著低于MTX组。
结论：rhG—CSF可减轻化疗导致的肠黏膜屏障功能的损伤。