论文部分内容阅读
一、目的本实验旨在探讨miR-21-5p在不同子宫内膜癌细胞Ishikawa及HEC-1A中的表达差异,上调或下调miR-21-5p对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。探寻miR-21-5p的直接靶标分子,为子宫内膜癌的诊断及治疗提供新的靶点。二、方法1.Real-time PCR法检测并分析不同子宫内膜癌细胞Ishikawa及HEC-1A中miR-21-5p的表达差异;2.利用脂质体转染法,以miR-21-5p mimics(上调miR-21-5p)及其对照(Negative control)或miR-21-5p inhibitor(下调miR-21-5p)及其对照(Inhibitor NC),分别转染Ishikawa及HEC-1A细胞,Real-time PCR法检测并分析miR-21-5p表达变化;3.CCK8实验检测上调/下调miR-21-5p对Ishikawa及HEC-1A细胞增殖能力的影响;4.Transwell实验及细胞划痕实验分别检测上调/下调miR-21-5p对Ishikawa及HEC-1A细胞迁移及侵袭的影响;5.利用targetscan、mirdb等靶基因预测软件,筛选与侵袭转移相关的mir-21-5p靶基因;6.上调hec-1a细胞中mir-21-5p的表达,real-timepcr检测靶基因(pitx2、vcl、jag1和fbxo11)mrna的变化;在ishikawa和hec-1a细胞中上调/下调mir-21-5p的表达,westernblot检测pitx2及vcl蛋白表达变化;7.构建mir-21-5p靶基因(pitx2、vcl、jag1和fbxo11)3’utr野生型的克隆载体和双荧光素酶重组载体;分别用脂质体瞬时转染,双荧光素酶(dual-luciferase)报告基因实验检测各转染组的双荧光素酶活性。三、结果1.mir-21-5p在hec-1a细胞中的表达明显高于ishikawa细胞;2.mir-21-5pmimics(对照组negativecontrol)转染到ishikawa及hec-1a细胞后,mir-21-5p的表达升高(ishikawa细胞升高140倍,hec-1a升高15倍);mir-21-5pinhibitor(对照组inhibitornc)转染到ishikawa及hec-1a细胞后,mir-21-5p的表达下降(ishikawa细胞降低2倍,hec-1a降低2.5倍);3.上调mir-21-5p能够促进ishikawa和hec-1a细胞的增殖能力,差异有统计学意义(p<0.05);下调mir-21-5p对ishikawa和hec-1a的增殖能力无显著影响;4.上调mir-21-5p能够促进ishikawa和hec-1a细胞的迁移及侵袭能力;下调mir-21-5p能抑制ishikawa和hec-1a的迁移及侵袭能力;差异具有统计学意义(p<0.05);5.targetscanhuman7.1预测显示mir-21-5p的“种子”区为“uauucga”,并筛选出与侵袭转移相关的mir-21-5p的靶基因pitx2、vcl、jag1和fbxo11;6.上调hec-1a细胞mir-21-5p的表达,靶基因pitx2、vcl、jag1和fbxo11的mrna与对照组相比呈显著降低趋势;上调ishikawa、hec-1a细胞中mir-21-5p的表达pitx2及vcl蛋白的表达降低;相反,下调mir-21-5p的表达时,可促进pitx2和vcl蛋白的表达;7.靶基因3’utr区克隆载体、野生型及突变型重组载体测序结果与预想一致;双荧光素酶结果显示,pitx2、vcl、jag1和fbxo11是mir-21-5p的直接靶基因。四、结论1.miR-21-5p在HEC-1A中的表达显著高于Ishikawa细胞。2.上调miR-21-5p能够促进Ishikawa细胞及HEC-1A细胞的增殖、迁移及侵袭能力。3.本实验证明了JAG1、FBX011、VCL和PITX2等基因是mi R-21-5p的靶基因。