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成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)是由众多成员组成的一个超家族。目前在哺乳动物中被鉴定的FGFs已有22种,它们广泛参与了细胞增殖、细胞迁移及细胞分化过程。其中,成纤维细胞生长因子10(fibroblast growth factor10,FGF10)为成纤维细胞生长因子家族的重要一员。
动物实验研究显示,在胚胎发育过程中,FGF10对肠上皮细胞的存活和增殖起到了至关重要的作用。此外,在尿路上皮的生长、分化和再生中,FGF10也起了重要调节作用。KrügerV等认为FGF10可作为肛门直肠畸形(anorectal malformation,ARM)和泄殖腔外翻(exstrophy of the cloaca,CE)的候选基因。FairbanksTJ等研究发现FGF10基因敲除小鼠表现出严重的肛门直肠畸形,证实了FGF10在正常肛门直肠发育过程中发挥了至关重要的作用。
综上所述,FGF10在动物后肠及肛门直肠形态发生中起到重要的作用,然而,目前尚无关于FGF10在人类泄殖腔,后肠及肛门直肠形态发生过程中表达模式的研究。FGF10是否参与人类泄殖腔的发育;FGF10在人类胚胎后肠及肛门直肠的发育过程中是否发挥作用尚不清楚。因此,为了明确FGF10在人类后肠及肛门直肠形态发生过程中的表达方式及可能的作用,我们应用免疫组化的方法系统的研究FGF10在人类肛门直肠发育的关键期即胎龄3～8周的时空表达方式。
实验方法：
一、标本
1、本研究遵守赫尔辛基宣言,并得到中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准(NO.200(7)PS14)。收集因意外妊娠而人工流产,发育正常的人胚胎标本85例(每例标本均取得产妇本人同意)。根据产妇末次月经时间、超声所测胎儿双顶径和人胚胎形态学特征等确定胎龄为3～8周。标本经0.01MPBS液冲洗后立即置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中4℃固定12小时～24小时,常规脱水,石蜡包埋,进行矢状面连续切片,厚度4μm。
2、标本立即经PBS(phosphate-bufferedsaline;pH7.4)冲洗后,4%多聚甲醛固定,常规方法脱水,制备蜡块,行矢状面连续切片。
二、试剂
(1)FGF-10多克隆抗体购自美国SantaCruz公司;
(2)免疫组化UltrasensitiveTMSP超敏试剂盒(产品编号kit-9701,kit-9709),多聚赖氨酸、DAB显色剂等购自博士德生物技术开发有限公司。
三、方法
通过免疫组化染色试验方法连续观察FGF10在人类胚胎泄殖腔、尿生殖窦以及肛门直肠时空性表达模式。
结果：
第3周时,尚未出现典型的泄殖腔(cloaca,CL)形态,免疫组化显示未见明显FGF10表达。
第4周时,典型的泄殖腔形态已出现,U型的尿直肠隔(urorectal septum,URS)将泄殖腔分隔为腹侧的尿生殖窦(urogenital sinus,UGS)和背侧的原始直肠/后肠(hindgut,H)。免疫组化显示FGF10大量表达于URS顶端及背侧上皮,星星点点表达在泄殖腔膜(cloacal membrane,CM)。而URS腹侧上皮及后肠处免疫反应几乎阴性。
第5周时,URS继续下降,其顶端与CM的距离逐渐减小。此时FGF10仍大量表达于URS顶端、背侧上皮及泄殖腔膜,但FGF10免疫组化反应强度较第四周弱。同时,后肠开始出现大量表达。而URS腹侧上皮处免疫反应几乎阴性。
第6周时,泄殖腔LIRS背侧顶端上皮FGF10免疫反应仍然持续强阳性,但CM及后肠FGF10表达明显减弱,且FGF10阳性细胞数量明显减小。同时,URS腹侧上皮FGF10免疫组化反应仍为阴性。
第7周时,CM破裂后,肛门直肠及UGS与羊膜腔相通,FGF10阳性细胞在肛管上皮消失,但尿道上皮出现FGFl0阳性细胞。
第8周时,肛管上皮FGF10表达仍为阴性,但尿道上皮FGF10阳性细胞较第7周弱,散在分布于尿道上皮。
结论：
在人类肛门直肠发育过程中(胎龄4～7周),FGF10在泄殖腔膜、背侧尿直肠隔表达阳性;当肛门直肠形成后,FGF10在肛门区域不再表达,提示FGF10在人类肛门直肠发育过程中可能发挥重要作用。