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基于荧光蛋白(Fluorescence proteins，FPs)的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)已经成为研究分子间相互作用与激酶活化的重要工具。FRET定量测量对于检测结果的交流和相互比较是必需的。基于受体敏化的光谱检测分析方法是目前用于活细胞FRET检测分析的主流定量FRET方法。虽然通过光谱的线性分离可以很容易的把样本光谱分成供体与受体部分，同时也消除了通道间发射光谱串扰，可是由于直接激发受体光谱与敏化受体光谱一样，光谱线性分离依然不能直接消除直接激发串扰。通用的光谱FRET方法需要增加一个参考样本在与待测样本相同的仪器设置下校正直接激发串扰。为了测量参与相互作用的受体与供体的浓度比，另外一个化学计量比为1∶1的校正样本也是不可或缺的。更为重要的是所有的测量样本包括待测样本和参考样本都必须保持相同的成像条件。 本文提出了一种新的活细胞光谱定量FRET检测新思想，发展了一种无需校正样本而直接用于活细胞FRET样本定量检测的光谱检测分析新技术，而且该方法可以通过调节成像系统的参数从而在最佳的成像条件下进行检测分析，因而适用于具有不同荧光基团浓度的活细胞样本。本论文主要分为两个部分: 1.发展了一种简单的测量激发波长λex处受体与供体消光系数比（γ(λec））的sp-ECR方法。消光系数比与在活细胞定量FRET极为重要的受体直接激发串扰有关。sp-ECR方法通过分离连接的供受体的发射光谱来测量在λex时受体与供体的γ(λex)而不需要任何其他的参考样本，这使得sp-ECR方法能够在最佳的成像设置下获取光谱图像。本文分别采用C32V和VCV两种FRET结构质粒在共聚焦显微镜上测量在458 nm激发下Venus/Cerulean消光系数比，而且sp-ECR和lux-FRET测量结果一致。另外，本文还用C32V、GFP-YFP和18AA质粒测量了其他细胞系中458 nm激发下Venus/Cerulean、YFP/GFP和YFP/CFP的消光系数比，实验结果表明受体与供体的消光系数比与细胞所处的生理环境有关。通过事先测量在458 nm激发下Venus/CFP的消光系数比，利用sp-ECR方法可以通过实时定量测量SCAT3的FRET效率变化来监测单个星孢菌素(STS)诱导的A549细胞中caspase-3的活化，实验结果显示STS诱导的凋亡细胞中caspase-3的活化在20分钟内就完成了。 2.基于利用预先测量的受体与供体消光系数比来校正受体直接激发串扰，本文提出一个新型的稳定和独立的发射光谱分离FRET定量检测方法(Iem-spFRET)。Iem-spFRET方法可以同时测量FRET效率（E)和受体与供体浓度比(RC）而不需要任何其它的参考样本，使得该方法避免了所有测量样本的成像条件必须保持相同这一严格限制，并且只需对实验样本进行直接测量。Iem-spFRET方法可以分为四个独立的步骤:(1)用标准灯源校正不同激发下的光谱成像系统，并且测量供体和受体标准光谱;(2)测量在两种激发下受体与供体消光系数比;(3)测量两种激发下FRET样本光谱并通过光谱线性分离得到供体与受体的权重;(4)通过得到的权重比来计算E和RC。其中，步骤(1)中光谱测量系统在一段时间内是稳定的，因此系统的校正和供受体光谱的测量是一次性的而不是每次实验都需要。另外，受体与供体消光系数比与激发光强度，探测增益和荧光团的浓度无关，因此步骤(2)中受体与供体消光系数比的测量只需测量一次后面的实验就可以直接引用。本文通过测量活细胞中CVC、VCV和VCVV质粒的E和RC来验证Iem-spFRET方法，测量结果与其它FRET定量检测方法测量结果一致。