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目的1．建立体外分析抗原特异性T细胞的检测方法--四聚体染色技术，为深入探讨表位特异性CTL的生物学功能以及更全面理解HBV特异CTL在HBV感染中的致病机理奠定实验基础；2．应用四聚体染色技术和流式染色分析抗原特异性CTL在自限性和慢性HBV感染中频率和生物学功能；3．分析HBV慢性感染者抗原特异性CTL细胞功能耗竭可能机制，为慢性感染免疫调节治疗提供可能途径和新的治疗靶点。方法1．应用基因工程技术原核高效表达HLA-A~*0201-BSP、HLA-A~*2402-BSP、HLA-A~*1101-BSP和β2m蛋白后，分别与常见的HBV抗原肽在体外复性折叠成可溶性的抗原肽复合物单体；经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体；分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例(5：1)耦合构建成四聚体。2．Dot blotting方法检测HLA-A~*0201-β2m-抗原肽、HLA-A~*2402-p2m-抗原肽、HLA-A~*1101-β2m-抗原肽复合物单体正确构象和生物素化；四聚体染色流式检测四聚体特异性。3．采用淋巴细胞分离液分离抗凝血的外周血单个核细胞(PBMC)；序列特异性引物聚合酶链反应(Sequence Specific Primer Polymerase Chain Reaction，SSP-PCR)分型技术确定HLA分型。4．入选病例用ELISA检测乙肝五项指标，Realtime-PCR定量检测HBV DNA。ELISA检测排除入选病例HAV、HCV、HDV、HEV、HIV病毒感染。5．应用四聚体染色技术检测表位特异性CTL的频率，借助流式细胞仪检测多肽体外刺激淋巴细胞产生IFN-γ的能力；流式染色检测细胞表面CD分子的表达；结合四聚体染色和细胞内细胞因子染色检测细胞因子(IL-10、TGF-β)的分泌。6．Sigmaplot软件作图，SPSS13．0对数据进行统计分析。结果1．构建了HLA-A~*0201 core18-27、pol575-583、env335-343；HLA-A~*2402 core117-125、pol756-764；HLA-A~*1101 core88-96、preS1 10-17抗原肽四聚体，所构建的七种四聚体都具有较好的特异性。2．抗原特异性CTL在自限性和慢性HBV感染者中频率和生物学功能：(1)自限性HBV感染患者外周循环中抗原特异性CTL的频率、增殖能力和分泌IFN-γ的能力明显高于慢性HBV感染者；自限性HBV感染者外周血中core特异性CTL的频率高于pol、env特异性CTL频率。(2)在慢性HBV感染者中只有一小部分低病毒滴度的患者抗原特异性CTL能够增殖和分泌IFN-γ，高病毒滴度的患者几乎丧失了抗原特异性CTL细胞增殖和分泌IFN-γ的能力；统计学分析结果显示：慢性HBV感染者外周血中HBV特异性CTL的频率同HBV DNA及ALT并没有显著相关性(p＞0．05)。(3)HLA-A~*0201／HLA-A~*2402，HLA-A~*0201／HLA-A~*1101，HLA-A~*1101／HLA-A~*2402限制性自限性HBV感染患者外周循环中抗原特异性CTL的频率均高于慢性HBV感染者，慢性HBV感染者外周血抗原特异性CTL频率很低，而且和HLA型别没有显著相关性。3．自限性和慢性HBV感染者CD8~+T细胞上CD127的表达频率没有显著性差异，而在慢性HBV感染者特异性CTL上CD127的表达要高于自限性感染组，统计学分析有显著性差异(p＜0．05)。4．自限性、慢性HBV感染者和未感染HBV者外周血CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD8~+T细胞的频率和CD4~+／CD8~+的比值统计学分析没有显著性差异(p＞0．05)。5．外周血中CD4~+T细胞、CD8~+T细胞分泌IL-10、TGF-β、IFN-γ能力在自限性或慢性HBV感染中均无显著性差异(p＞0．05)。6．在自限性和慢性HBV感染中，阻断IL-10／IL-10R或TGF-β／TGF-βR相互作用后，抗原特异性CTL的频率、分泌IFN-γ的能力均增加，特别是阻断TGF-β／TGF-βR相互作用后，抗原特异性CTL的频率、分泌IFN-γ的能力增加较强。结论1．构建的七种四聚体都具有较好的特异性，能够检测到表位特异性CTL。2．在自限性HBV感染者外周血中这七种抗原特异性CTL的频率、体外抗原肽刺激后的增殖能力及分泌IFN-γ的能力均较慢性感染者高；慢性HBV感染患者外周血中抗原特异性CTL频率一般较低，甚至检测不到；只有一小部分低病毒滴度的患者外周血中抗原特异性CD8~+T能够增殖和分泌IFN-γ，高病毒滴度的患者几乎丧失了抗原特异性CD8~+T细胞增殖和分泌IFN-γ的能力。3．细胞因子IL-10和TGF-β在HBV感染者T细胞应答低下、抗原特异性CTL功能耗竭中起作用。体外阻断IL-10／IL-10R或TGF-β／TGF-βR相互作用可以提高抗原特异性CTL的频率、分泌IFN-γ的能力。本研究的创新点1．应用现有文献报道的表位，结合四聚体技术对不同HLA限制性表位特异CTL在中国自限性和慢性HBV感染者中频率和生物学功能进行了初步研究，特别对在中国具有较高频率HLA-A~*2402和HLA-A~*1101限制性CTL的研究。并分析了HLA-A~*0201／HLA-A~*2402，HLA-A~*0201／HLA-A~*1101，HLA-A~*1101／HLA-A~*2402限制性自限性和慢性HBV感染者体内抗原特异CTL频率和优势表位。2．对IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子在HBV特异性CTL功能耗竭机制进行了初步研究，并通过体外实验阻断IL-10／IL-10R或TGF-β／TGF-βR相互作用可以提高病毒特异性CTL的频率和功能，为慢性感染免疫治疗提供新的治疗靶点。本研究的意义1．应用四聚体染色技术系统分析了不同HLA限制性不同表位肽特异性CTL在自限性和慢性HBV感染者的频率及生物学功能，有助于我们更全面理解HBV特异CTL在HBV致病机理中的作用，也有利于HBV治疗性疫苗的研制。2．对HBV感染中抗原特异性T细胞功能失能可能机制研究，为慢性感染免疫治疗提供新的治疗靶点。