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伪狂犬病(Pseudorabies,PR或Aujeszky’s disease,AD)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种急性传染病。猪是伪狂犬病毒的唯一贮存宿主,该病毒的潜伏特性导致该病的难以根除和净化。PRV跟其他的甲型疱疹病毒基因组一样,按照严格的级联方式调节基因组的表达,即在复制转录的生命周期中被分为立即早期基因、早期基因和晚期基因。值得我们关注的是PRV不同于其他甲型疱疹病毒,它仅有一个立即早期基因即IE180,且同单纯疱疹病毒(HSV-1)的ICP4基因同源。IE180是PRV基因组中第一个被转录表达的蛋白,其作为强有力转录激活因子,对病毒基因组起始复制和早期转录是必需的。PRV基因组中存在着两个IE180基因拷贝,早期研究证实将IE180基因两个拷贝同时缺失而构建的重组克隆,这种重组克隆不感染宿主也不感染细胞而彻底丧失感染能力,不能拯救出活病毒。此外,PRV有着较为广泛的宿主谱,并逐渐被病毒学家们用做一个研究疱疹病毒分子生物学的模式生物并在动物模型中被广泛应用于神经追踪。目前,PRV IE180的生物学功能尚不完全明确,为进一步深入研究PRV IE180的功能,我们构建了IE180启动子缺失的重组克隆。本研究在本实验室已有的PRV JS-2012株感染性克隆pBAC-JS2012的基础上利用GALK正筛选系统和卡那霉素标记基因构建了PRV IE180双启动子缺失克隆,为后续获得稳定的IE180基因互补缺失系统提供便利的框架支持。而这种互补缺失系统为寻找与IE180基因在基因组调控上有密切关联的其他表达分子提供了相对稳定的操作平台。1.IE180多克隆抗体的制备。分析IE180基因全长氨基酸序列,截取抗原表位较好的三段基因序列克隆到pcold-TF载体上构建重组原核表达质粒pcold-TF-IE180a、pcold-TF-IE180b和pcold-TF-IE180c,三种重组表达质粒经过诱导后IE180蛋白均能表达。将纯化效果较好的重组蛋白His-IE180b和His-IE180c免疫小鼠,分离血清,获得的IE180多克隆抗体均能用于IFA和Western blot检测和分析。2.伪狂犬病毒IE180基因启动子缺失克隆的构建。在本实验室已有的PRV JS-2012感染性克隆pBAC-JS2012及突变筛选菌株SW102-PRVBAC基础上,利用galk正筛选和卡那霉素的筛选标记基因,构建IE180两个拷贝启动子均删除的缺失克隆。利用同源重组将galk表达盒替换掉IE180TATA-box及左边297bp碱基和右边172bp碱基,经PCR鉴定和筛选获得阳性克隆SW102-galk。通过Weston blot分析,IE180仍然存在表达。再利用卡那霉素标记基因的筛选将kna标记基因替换掉另一个拷贝IE180TATA-box及其左边134bp和右边309bp碱基,经过PCR鉴定、RFLP分析、Western blot分析以及转染后绿色荧光表达的分析,证实IE180不再表达,本研究成功筛选到IE180启动子缺失的阳性克隆pPRV-DIE180-BAC。3.伪狂犬病毒IE180缺失互补系统的构建。为了弥补p PRV-DIE180-BAC中IE180的缺陷表达,本文利用IE180基因全长中独有的酶切位点pvuⅠ将IE180基因分段扩增,构建IE180真核表达质粒pCAGGS-IE180,其转染细胞后,Western blot结果显示,IE180蛋白获得表达。该质粒与IE180缺失克隆pPRV-DIE180-BAC共转染细胞时,p CAGGS-IE180能弥补p PRV-DIE180-BAC中IE180基因的缺失,实现IE180基因缺失后病毒粒子的复制。