论文部分内容阅读
氧化应激(oxidativestress)是指由于氧自由基过量生成和/或细胞内抗氧化防御系统受损，导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态，与多种疾病的发生发展有关。氧化还原因子-1(Redoxeffectfactor-1)又称作脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶(apurinic/apyrimidinicendonuclease)，是细胞内广泛存在的一种多功能蛋白。它在细胞碱基修复途径中作用于脱嘌呤/脱嘧啶位点，主要参与由于氧化性损伤造成的DNA损害的修复；同时，Ref-1也是一种氧化还原作用因子，影响多种核转录因子的DNA结合活性，通过对核转录因子的氧化还原修饰来调节细胞基因的表达。此外，Ref-1在细胞凋亡、细胞周期调控、肿瘤生理及细胞氧化应激中都发挥重要的作用。
近年来，有关Ref-1在抗氧化性损伤作用机制的研究逐步深入。多种应激诱导Ref-1表达增加可抑制细胞凋亡的发生，但其机制尚不明确。本课题通过改变Ref-1蛋白在HEK293细胞中的表达，观察其对细胞抗氧化性损伤的功能影响，并探讨可能的机制，为进一步研究Ref-1抗氧化性损伤的机制提供新的思路和理论基础。
主要研究方法和结果：
1.构建逆转录病毒载体PLEGFP-N1介导的Ref-1高表达载体。利用RT-PCR方法从Hela细胞中克隆人的全长Ref-1cDNA片段，将其插入逆转录病毒载体PLEGFP-N1的多克隆位点，Ref-1与质粒载体上EGFP片段之间以内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IRES)相连，构建逆转录病毒载体介导的Ref-1高表达载体。测序及酶切结果表明，从Hela细胞中成功扩增人的全长Ref-1cDNA片段，载体构建正确。
2.构建逆转录病毒载体Pmscv/hyg介导的Ref-1RNA干扰载体。PCR扩增人U6启动子序列和EGFP序列，分别插入逆转录病毒载体Pmscv/hyg。在Ref-1的mRNA链上分别选定4个不同位点作为干扰的目标序列，化学合成寡核苷酸，在U6启动子的下游插入干扰序列获得shRNA-Ref-1表达体。测序及酶切结果表明重组载体构建成功。
3.病毒感染HEK293细胞。重组质粒PLEGFP-N1-Ref-1和Pmscv-Ref-1-siRNA及相关对照质粒分别转染病毒包装细胞PT-67，24小时后收集上清感染靶细胞。抗生素G418和Hygromycin分别筛选阳性细胞14天。RT-PCR及westernblot检测Ref-1mRNA及蛋白表达。
4.调节Ref-1表达对细胞抗氧化损伤的影响。200μM、400μM、600μMH2O2分别刺激Ref-1高表达及对照组细胞30min，12小时后MTT实验及流式细胞仪检测各组细胞间死亡率无显著性差异(P>0.05)。亚致死量(200μM)H2O2刺激Ref-1低表达及对照组细胞30min，12小时后收集细胞，流式细胞仪术、MTT实验及Hoechest33258染色法证实沉默Ref-1增加细胞对氧化刺激的敏感性：细胞死亡率升高，活力下降(P<0.05)。同时，下调Ref-1减弱细胞内ROS清除能力。
5.Westernblot检测Bcl-2、Bax、caspase-3和cytochromec。下调Ref-1的表达增加细胞对H2O2诱导凋亡的敏感性，Westernblot检测在此过程中Bcl-2上调受到抑制，而Bax升高，caspase-3被激活，cytochromec从线粒体中释放。
结论及研究意义:1.构建了高效抑制蛋白表达的逆转录病毒载体2.高表达Ref-1不能提高细胞对氧化性损伤的抵抗3.抑制Ref-1的表达增加细胞对氧化性损伤的敏感性，Bcl-2上调受到抑制，Bax表达升高，caspase-3被激活，cytochromec释放。
本研究证实抑制Ref-1的表达引起细胞对氧化性损伤敏感性增加，同时Bcl-2上调受到抑制，Bax表达升高，caspase-3被激活，cytochromec释放，是一种典型线粒体介导的凋亡通路。由此，我们推测Ref-1在氧化应激中与Bcl-2家族蛋白的表达相关，从而影响线粒体通路，为探讨Ref-1的抗氧化性损伤的机制提供新的观点。