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番木瓜环斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV)严重影响番木瓜的生产,用常规的方法无法防治番木瓜环斑病毒病害(papayaringspotdisease,PRSD),而通过病毒基因的转化却可以有效防治这种病害。
本研究克隆了华南地区PRSV优势株系Ys的复制酶基因……基因YsA,优势株系Vb的外壳蛋白基因片段……基因片段VbA,由Ys的复制酶基因片段和Vb株系的外壳蛋白基因片段融合而成的融合基因VY,以及由Ys的复制酶基因和Vb株系的外壳蛋白基因片段组成的基因VYC。经过PCR鉴定,双酶切鉴定以及测序分析结果表明,基因YsA和基因片段VbA分别转入了植物表达载体pBI121中,融合基因VY和基因VYC分别转入了植物表达载体pCAMBIA2300中,这些重组子都已成功地导入了农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105中。
本研究建立了“美中红”,“红妃红”,“夏威夷”番木瓜胚性组织的转化体系。在番木瓜愈伤组织和体胚过程诱导中应选取子叶和内外种皮都为白色且个体较大的白色番木瓜幼胚进行诱导。若诱导培养基中不含2,4-D,则不论是在周期性光照还是黑暗条件下,番木瓜幼胚都无法诱导愈伤组织和体胚;若诱导培养基中含有2,4-D,可以诱导愈伤组织和体胚。在诱导培养基上培养15天,番木瓜幼胚愈伤组织的诱导率随着2,4-D浓度的增加而增加;在周期性光照条件下,番木瓜体胚成白色,黑暗条件下,体胚成淡黄色。
组织学观察表明,番木瓜幼胚培养时,愈伤组织最先发生于靠近胚根端(形态学的下端)的表皮细胞,有干性和粘性两类。体胚的发生方式有直接和间接两种,间接方式是胚轴先形成愈伤组织,再从愈伤组织表面长出体胚;直接发生方式则不经过愈伤组织阶段直接从胚轴上形成体胚。本实验中所形成的体胚多数是以间接方式发生,有些体胚从胚性复合前体或体胚上直接产生。本研究在诱导培养基上观察到了体胚发育中的球形胚、心形胚、鱼雷状胚以及成熟体胚,这表明番木瓜体胚的形态发生与其合子胚的发生阶段相似。番木瓜正常的体胚比变异的体胚萌发能力强。体胚萌发时,有些先长出芽,有些先长出根,无论是哪种发生方式,具有萌发能力的单个体胚都能发育成完整的小植株。
本研究分别采用了三种转化方法对番木瓜进行转化,分别是农杆菌共培养转化法,真空渗透辅助农杆菌转化法,超声波辅助农杆菌转化法。这三种转化方法转化受体各不相同,农杆菌共培养法的转化受体是由幼胚培养而获得的胚性组织(包括体胚和愈伤组织),真空渗透辅助农杆菌转化法的转化受体是番木瓜的小苗,超声波辅助农杆菌转化法的转化受体是番木瓜的两性花。通过超声波辅助农杆菌转化法获得了一棵转基因的番木瓜。农杆菌共培养转化法获得了在抗生素筛选培养基上再生的胚性组织,虽然经PCR检测部分再生的胚性组织呈阳性,但仍需要培养成苗后进一步检测分析,这项工作正在进行中。真空渗透辅助农杆菌转化法未获得转化的番木瓜。不需要通过组织培养的真空渗透辅助农杆菌转化法和超声波辅助农杆菌转化法转化方法值得一试,但转化条件还需进一步研究。
在用农杆菌共培养法转化番木瓜时,转化材料常因农杆菌污染而导致转化失败。本研究通过三步处理,即共培养时滤纸处理,抗生素洗涤以及洗涤后的干燥处理,共培养后农杆菌在胚性组织表面的生长基本得到抑制,更有利于番木瓜胚性组织的生长。
本研究建立了一套转双基因番木瓜的多重PCR检测体系。在研究中发现,检测双基因时,多重PCR对退火温度,dNTP浓度,rTaq浓度及模板总DNA要求都不高,但是在同一反应体系中,要求两对引物的浓度比为1:1,在其他浓度下,PCR扩增效果不理想。