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目的: 子宫内膜异位症在病理上呈良性形态学表现，却具有类似恶性肿瘤的种植、侵蚀和远处转移能力，其发病机制尚未阐明。内异症患者的在位内膜差异表达基因作为影响子宫内膜生物学特性变化的重要因素之一，在内异症的发生发展中起着重要作用。本课题组通过cDNA代表性差异分析技术得到内异症在位内膜上调差异表达基因10个，其中COX-2、BRAF、NRAS基因与内异症的相关性已经多有报道，cofilin1基因在内异症中的作用也已经在本课题组的前期研究中得到证，但其作用机制尚不明确。 cofilin1的磷酸激酶LIM激酶1(LIMK1)通过磷酸化cofilin1 ser3位点使其失活，引起肌动蛋白单体的异常积聚，最终引起肌动蛋白所介导的细胞骨架的改变。因此，有研究表明LIMK1通过对cofilin1的调节参与细胞的分裂、侵袭、转移、血管形成等，这与cofilin1的生物学功能相似。另有研究发现，雌激素通过激活LIMK1磷酸化cofilin1，p-cofilin1因不能切割肌动蛋白而促进神经元伪足的形成，伪足的形成可提高细胞的运动性，促进侵袭和迁移。内异症作为雌激素依赖性疾病，雌激素不但与疾病的发生、发展密切相关，抑制雌激素代谢也是内异症治疗的重要靶向之一，而对于生育年龄妇女低雌导致的各种副作用是治疗主要障碍。因此探讨雌激素作用的下游细胞因子作用机制，逃避雌激素干扰，达到内异症靶向治疗的目的具有重要意义。 本课题组前期证实cofilin1在内异症在位内膜细胞中高表达使内异症在位内膜具有更强的粘附、侵袭、血管生成、抗凋亡能力增强等恶性肿瘤细胞样改变，但cofilin1在内异症中的具体作用机制尚不明确，且LIMK1在内异症的作用尚无研究。因此本研究将探讨LIMK1在内异症发生发展中的作用，及LIMK1介导的雌激素对cofilin1的调节作用，进一步阐明cofilin1在内异症中的作用机制。 方法: 一、LIMK1在子宫内膜异位症在位内膜及正常子宫内膜中的表达 利用实时荧光定量PCR方法和蛋白免疫印迹技术检测LIMK1 mRNA和蛋白在子宫内膜异位症在位内膜和正常子宫内膜中的表达。 二、体外实验研究LIMK1对子宫内膜异位症在位内膜细胞(EC)及正常子宫内膜细胞(NC)生物学活性的影响 （一）原代培养EC及NC。 （二）免疫细胞化学染色鉴定细胞。 （三）病毒感染EC沉默LIMK1，病毒感染NC重组LIMK1。 （四）实时荧光定量PCR检测在EC中LIMK1基因RNA干扰后及NSC中LIMK1基因重组后LIMK1 mRNA表达水平。 （五）蛋白免疫印迹检测在EC中LIMK1基因RNA干扰后及NC中LIMK1基因重组后LIMK1蛋白表达水平。 （六）CCK-8细胞增殖实验检测LIMK1表达改变前后细胞增殖的变化。 （七）Transwell细胞侵袭实验检测LIMK1表达改变前后细胞侵袭能力的改变。 （八）细胞划痕实验检测LIMK1表达改变前后细胞迁移能力的改变。 （九）酶联免疫吸附试验检测LIMK1表达改变前后ICAM-1、VEGF、MMP-9在细胞培养上清中的含量变化。 三、雌激素对LIMK1/cofilin1的磷酸化调节作用对内异症在位内膜细胞生物学活性的影响 （一）、不同时间雌激素干预EC。 （二）、雌激素及其受体拮抗剂(ICI182780)干预EC。 （三）、雌激素干预病毒感染后的EC。 （四）、CCK-8细胞增殖实验检测LIMK1表达改变前后雌激素对细胞增殖的变化。 （五）、Transwell细胞侵袭实验检测LIMK1表达改变前后雌激素对细胞侵袭能力的改变。 结果: 一、LIMK1在子宫内膜异位症在位内膜及正常子宫内膜中的表达 实时荧光定量PCR结果显示以正常内膜LIMK1 mRNA相对表达水平的平均值为1，LIMK1在内异症在位内膜中相对表达水平是正常内膜的2.44倍，比较差异有统计学意义（P＜0.01）;蛋白免疫印迹显示以正常内膜LIMK1蛋白相对表达水平的平均值为1，LIMK1蛋白表达水平在内异症组在位内膜的相对表达水平为正常内膜的2.67倍，比较差异有统计学意义(P＜0.01)。 二、LIMK1对子宫内膜异位症在位内膜细胞及正常内膜细胞生物学活性的影响 （一）免疫细胞化学染色鉴定 细胞免疫组结果表明细胞波形蛋白染色阳性，角蛋白阴性，证实为子宫内膜间质细胞;波形蛋白染色阴性，角蛋白染色阳性，证实为子宫内膜上皮细胞。 （二）病毒感染EC和NC。 （三）各组细胞实时荧光定量PCR结果 基础状态下，EC组LIMK1 mRNA相对水平显著高于NC组，LIMK1 RNAi组mRNA相对水平分为与EC组比较明显降低，NC重组LIMK1组mRNA相对水平显著高于NC组。 （四）各组细胞蛋白免疫印迹结果 基础状态下，EC组LIMK1蛋白相对水平显著高于NC组，LIMK1 RNAi组LIMK1蛋白相对水平为与EC组比较明显降低，NC重组LIMK1(LIMK1-cDNA)组蛋白相对水平为显著高于NC组。 （五）CCK-8细胞增殖实验结果 根据生长曲线结果显示转染含LIMK1 siRNA病毒的EC增殖能力明显受抑制，而转染含LIMK1 cDNA病毒的NC增殖能力显著提高。 （六）细胞侵袭实验结果 基础状态下，EC侵袭力显著高于NC，LIMK1基因沉默的EC侵袭力显著下降，而病毒转染后LIMK1基因表达增加的NC侵袭力明显增强。 （七）细胞划痕实验结果 自然状态下，EC迁移能力显著高于NC;转染含LIMK1 siRNA病毒的EC迁移能力显著下降，而转染含LIMK1cDNA病毒的NC迁移能力明显增强。 （八）酶联免疫吸附试验结果 自然状态下，EC较NC分泌更多的ICAM-1、VEGF及MMP-9;转染含LIMK1siRNA病毒的EC分泌三种细胞因子的量明显下降;转染含LIMK1 cDNA病毒的NC分泌三种细胞因子的量明显上升。 三、雌激素对LIMK1/cofilin1的磷酸化调节作用对内异症在位内膜细胞生物学活性的影响 （一）雌激素对p-LIMK1和p-cofilin1表达水平改变的时间梯度 雌激素干预6h后p-LIMK1和p-cofilin1相对表达水平明显增加，LIMK1和cofilin1相对表达水平无明显改变。 （二）雌激素拮抗剂对p-LIMK1和p-cofilin1表达水平的影响 经ICI182780预处理后的细胞雌激素干预6h(EC-ICI182780-E2)， p-LIMK1和p-cofilin1的相对表达水平明显低于雌激素干预6h(EC-E2)后的相对表达水平，而LIMK1和cofilin1的相对表达水平无明显改变。 （三）LIMK1基因沉默后，雌激素对p-LIMK1和p-cofilin1的磷酸化作用 LIMK1基因沉默后(EC-LIMK1-RNAi) LIMK1和p-LIMK1的相对表达水平明显下降，雌激素干预LIMK1基因沉默后（EC-LIMK1-RNAi-E2）LIMK1和p-LIMK1的相对表达水平明显增加。EC-LIMK1-RNAi组细胞cofilin1相对表达水平无明显改变，而p-cofilin1的表达水平明显下将;EC-LIMK1-RNAi-E2组细胞cofilin1和p-cofilin1的相对表达水平无明显改变。 （四）LIMK1基因沉默前后雌激素对EC增殖能力的改变 EC-LIMK1-RNAi组细胞的相对增殖能力明显低于EC组，EC-E2组细胞的相对增殖能力明显高于EC组。EC-LIMK1-RNAi-E2组细胞的相对增殖能力与EC-LIMK1-RNAi组细胞相比较无统计学差异，与EC-E2组相比较相对增殖能力明显下降。 （五）LIMK1基因沉默前后雌激素对EC侵袭能力的改变 EC-LIMK1-RNAi组细胞的侵袭力明显低于基础状态下的EC组，EC-E2组细胞的侵袭力较基础状态下EC组细胞侵袭力明显增强。EC-LIMK1-RNAi-E2组细胞的侵袭力较EC-E2组细胞明显下降，与LIMK1-RNAi组细胞侵袭力比较差异无统计学意义。 结论: （一）LIMK1在内异症在位内膜细胞中高表达。 （二）内异症在位内膜细胞中LIMK1的高表达与在位内膜细胞的高增殖、侵袭、迁移和分泌ICAM-1、VEGF及MMP-9三种细胞能力密切相关，沉默在位内膜细胞LIMK1基因，可降低细胞的增殖、侵袭、迁移和分泌细胞因子的能力。 （三）雌激素通过LIMK1/cofilin1途径促进内异症在位内膜细胞的侵袭和增殖能力。