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目的：
心肌肥大是指心肌细胞体积增大而无细胞分裂，其特征是心脏体积增大和蛋白质合成率增加。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一具有多种生物学效应的炎症性细胞因子，主要由激活的巨噬细胞产生，心肌细胞也可产生。在内毒素的刺激下心脏心肌细胞和巨噬细胞几乎产生同样多的TNF-α。目前研究表明，感染和内毒素血症是心脏产生TNF-α的重要刺激因素，TNF-α，的局部升高可直接影响心功能，并参与多种心脏疾病如充血性心力衰竭、心肌炎、缺血性心脏病的病理生理过程。研究证明TNF-α诱导心肌肥大性反应。但是，TNF-α，诱导心肌肥大的分子机制尚未完全阐明。大量研究表明：胞内Ca2+信号的改变是肥厚反应的首要刺激，在心脏肥厚和基因表达中发挥中心作用，其通过激活下游的酶来发挥第二信使的功能。目前认为有两种钙介导的信号转导机制参与了心肌肥厚的发生与发展：一是钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)介导途径；二是钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ)信号转导途径。本研究以体外培养的乳鼠心肌细胞为模型，探讨TNF-α对心肌细胞内Ca2+浓度的影响以及Ca2+在TNF-α诱导心肌肥大中的作用；在此基础上进一步探讨Ca2+下游两个重要的钙调节酶CaMKⅡ和CaN在TNF-α诱导心肌肥大中的作用，以揭示TNF-α，诱导心肌肥大的信号通路。
研究表明：磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)参与心肌细胞Ca2+信号的调节。而PI3K在心肌肥厚发生中起到重要作用。有报道：PI3K-Akt/PKB途径的激活在TNF-α诱导的心肌细胞蛋白合成增加中起到重要作用。那么TNF-α诱导心肌肥大中激活的PI3K是否参与了[Ca2+]i的调节以及Ca2+/CaMK/CaN信号通路与PI3K途径是否有关联？本课题将从细胞水平及分子水平对上述内容进行研究探讨。
方法：
第一部分：
1、观察TNF-α，不同浓度和不同作用时间对培养乳鼠心肌细胞蛋白含量的影响
采用Lowrys法测定蛋白质含量。分为对照组和浓度(μg/L)为10、20、50、100、200的TNF-α组，继续培养72h后进行蛋白含量的测定，摸索TNF-α诱导心肌肥大的量效曲线，选择最佳作用浓度。
分为对照组和浓度为100μg/L的TNF-α实验组，继续培养0、12、24、48、72和96h后进行蛋白含量的测定。探讨TNF-α诱导心肌肥大的时效曲线，选择最佳作用时间。
2、观察TNF-α，对培养心肌细胞内Ca2+浓度的影响
采用两个测定指标：一是利用荧光指示剂Fura-2测定细胞内Ca2+瞬变；二是应用Fluo-3/AM荧光标记技术及共聚焦显微镜检测单个心肌细胞内Ca2+浓度变化。观察100μg/L TNF-α对心肌[Ca2+]i的影响，并进一步应用IP3R拮抗剂2-APB、RyR拮抗剂ryanodine以及L型Ca2+通道阻断剂nifedipine等工具药观察TNF-α，诱导培养心肌细胞[Ca2+]i增加的来源及途径。Ca2+瞬变测定共设6组，①对照组；②TNF-α(100μg/L)组；③IP3R阻断剂2-APB(30μM)+TNF-α，(100μg/L)组；④RyR阻断剂ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组：⑤L型Ca2+通道阻断剂nifedipine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组；⑥IP3R阻断剂2-APB(30μM)+RyR阻断剂ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组。上述阻断剂预孵育30min后上机测定。先记录一段基础值，观察各阻断剂对正常心肌细胞[Ca2+]i瞬变有无影响；再加入TNF-α(100μg/L)，观察TNF-α刺激前后钙瞬变的变化。
3、观察IP3R阻断剂2-APB、RyR阻断剂ryanodine以及L型Ca2+通道阻断剂nifedipine对TNF-α，诱导心肌肥大的影响
共设9组：①对照组；②TNF-α(100μg/L)组；③IP3R阻断剂2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)组；④RyR阻断剂ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组：⑤L型Ca2+通道阻断剂nifedipine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组；⑥IP3R阻断剂2-APB(30μM)+RyR阻断剂ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组：⑦2-APB(30μM)组：⑧ryanodine(50μM)组；⑨nifedipine(50μM)组。给药72 h后分别进行肥大指标测定，包括蛋白含量、蛋白合成及细胞体积。采用Lowrys法测定蛋白质含量，采用同位素示踪[3H]-leucine掺入法测定蛋白合成，通过计算机图象分析系统测定心肌细胞体积。
第二部分：
1、观察CaMKⅡ和CaN在TNF-α，诱导的心肌肥大中的作用
实验共设6组：①对照组：②TNF-α(100μg/L)组：③CaMK阻断剂KN93(0.2μmol/L)+TNF-α(100μg/L)组：④CaN阻断剂CsA(0.2μmol/L)+TNF-α，(101μg/L)组：⑤CaMK阻断剂KN93(0.2μmol/L)组：⑥CaN阻断剂CsA(0.2μmol/L)组。阻断剂较TNF-α提前30min加入。给药72h后进行蛋白含量、蛋白合成及细胞体积的测定。测定方法同前。
2、检测TNF-α，对心肌细胞CaMKⅡδB和CaN蛋白表达的影响
应用Western blot法测定心肌细胞内CaMKⅡδB和CaN蛋白表达。分为2组：①对照组：②TNF-α(100μg/L)组。给药后继续培养48h/72h后收集细胞，测定。
第三部分：
1、观察PI3K对TNF-α诱导的心肌细胞[Ca2+]i变化的影响
应用Till阳离子测定系统测定细胞内Ca2+瞬变以及应用激光共聚焦显微镜检测单个心肌细胞内Ca2+浓度变化。Ca2+瞬变测定设8组：①对照组；②TNF-α(100μg/L)组；③2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)；④ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)：⑤2-APB(30μM)+ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)；⑥LY294002(50μM)+TNF-α(100μg/L)；⑦LY294002(50μM)+2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)：⑧LY294002(50μM)+ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)。先记录一段基础值，观察各阻断剂对正常心肌细胞[Ca2+]i瞬变有无影响；再加入TNF-α(100μg/L)，观察TNF-α刺激前后钙瞬变的变化。
激光共聚焦显微镜检测共设5组：①对照组；②TNF-α(100μg/L)组：③PI3K阻断剂LY294002(50αM)+TNF-α(100μg/L)；④PI3K阻断剂LY294002(50μM)+IP3R阻断剂2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)；⑤PI3K阻断剂LY294002(50μM)+RyR阻断剂ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组。上述阻断剂预孵育30min后上机测定。先记录一段基础值后，再加入TNF-α(100μg/L)，观察TNF-α刺激前后[Ca2+]i的变化。
2、观察PI3-K对TNF-α诱导心肌肥大的影响
共设7组：①对照组：②TNF-α(100μg/L)：③IP3R阻断剂2APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)组：④PI3-K阻断剂LY294002(50μM)+TNF-α(100μg/L)组：⑤PI3-K阻断剂LY294002(50μM)+IP3R阻断剂2APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)组：⑥PI3-K阻断剂LY294002(50μM)+RyR阻断剂ryanodine(50μM)+TNF-α(100μg/L)组；⑦PI3-K阻断剂LY294002(50μM)。各阻断剂均在TNF-α加入前30min加入。给药72h后分别进行蛋白含量、蛋白合成及细胞体积的测定。测定方法同前。
3、观察PI3K对TNF-α诱导心肌细胞CaMKⅡδB和CaN表达的影响
分为4组：①对照组；②TNF-α(100μg/L)；③PI3K阻断剂LY294002(50μM)+TNF-α(100μg/L)组；④PI3K阻断剂LY294002(50μM)+IP3R阻断剂2-APB(30μM)+TNF-α(100μg/L)组。给药48/72h后收集细胞，应用Western blot法测定心肌细胞内CaMKⅡδB/CaN蛋白表达。
结果：
第一部分：
1、TNF-α，不同浓度及不同作用时间对培养心肌细胞蛋白含量的影响
TNF-α诱导培养乳鼠心肌细胞蛋白含量增加，在10～100μg/L浓度范围内呈浓度依赖性；在12～72 h内呈时间依赖性。
2、TNF-α对培养心肌细胞内钙离子浓度的影响
TNF-α(100μg/L)诱导心肌内钙离子浓度增高(P<0.01)。IP3R阻断剂2-APB(30μmol/L)和/或RyR阻断剂ryanodine(50μmol/L)明显抑制上述反应，且二者合用抑制作用更明显。L型Ca2+通道阻断剂nifedipine(50μmol/L)对TNF-α诱导的心肌细胞内钙离子浓度增高无明显影响(P>0.05)。各阻断剂对正常心肌细胞钙离子浓度无明显影响。
3、2-APB、ryanodine以及nifedipine对TNF-α诱导的心肌细胞肥大的作用
IP3R阻断剂2-APB(30μmol/L)和/或RyR阻断剂ryanodine(50μmol/L)明显抑制TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞蛋白含量、蛋白合成以及细胞体积的增加(P<0.01)。L型Ca2+通道阻断剂nifedipine(50μmol/L)对TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞蛋白含量、蛋白合成以及细胞体积的增加无明显影响(P>0.05)。上述阻断剂对正常心肌细胞蛋白含量、蛋白合成及细胞体积无明显影响(P>0.05)。
第二部分：
1、CaMKⅡ和CaN对TNF-α，诱导的心肌细胞肥大的影响
CaMKⅡ抑制剂KN93(0.2μmol/L)或CaN抑制剂CsA(0.2μmol/L)明显抑制TNF-α诱导的心肌细胞蛋白含量、蛋白合成量以及细胞体积的增加(P<0.01)。CaMKⅡ抑制剂KN93(0.2μmol/L)和CaN抑制剂CsA(0.2μmol/L)对『F常心肌细胞蛋白含量、蛋白合成及细胞体积无明显影响(P>0.05)。
2、TNF-α对心肌细胞CaMKⅡδB和CaN表达的影响
TNF-α诱导心肌细胞CaMKⅡδB和CaN表达显著增加(P<0.01)。
第三部分：
1、PI3K对TNF-α诱导的心肌细胞内钙离子浓度增高的影响
PI3K阻断剂LY294002(50μM)明显抑制TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞内钙离子浓度增高(P<0.01)，对正常心肌细胞[Ca2+]i无明显影响。其抑制作用与LY294002+2-APB组相近(P>0.05)，小于LY294002+ryanodine组(P<0.05)。
2、PI3K对TNF-α诱导心肌肥大的作用
LY294002(50μM)明显抑制TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞蛋白含量、蛋白合成及细胞体积的增加(P<0.01)；其抑制程度与LY294002(100μM)+2-APB(30μM)无统计学差异(P>0.05)，但明显大于2-APB(30μM)组，小于LY294002+ryanodine(50μM)组。LY294002(50μM)对正常心肌细胞蛋白含量、蛋白合成及细胞体积无明显影响(P>0.05)。
3、PI3K对TNF-α，诱导心肌细胞CaMKⅡδB和CaN表达的影响
PI3K阻断剂LY294002(50μM)明显抑制TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞CaMKⅡδB和CaN表达增加(P<0.01)，其抑制程度与LY294002+2-APB(30μM)组相近(P>0.05)。
结论：
1、TNF-α通过作用IP3R和RyR而非打开L型Ca2+通道引起胞内钙离子浓度增加，从而诱导心肌肥大。
2、TNF-α诱导的心肌肥大与CaMKⅡδB和CaN表达增加有关。
3、TNF-α激活的PI3K可能部分通过作用IP3R使心肌细胞内Ca2+浓度增加，进而调节细胞内CaMKⅡδB和CaN的表达，从而诱导心肌细胞肥大。