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【背景】胃癌是我国常见的恶性肿瘤，其致死率位于在恶性肿瘤致死率的第二位。转移是导致胃癌病人死亡的首要原因。尽管国内外许多学者对胃癌的转移的分子调控网进行了深入的探讨，然而胃癌转移的分子机制远未阐明。由于肿瘤细胞是异质性群体，同一细胞系中可能存在不同生物学特性的细胞亚群，我们以背景来源相同转移潜能不同的细胞亚系为研究对象，进行高通量转录因子活性谱芯片检测，筛选胃癌转移相关的转录因子，发现PAX3在高转移细胞系中的活性升高。PAX3是PAX转录因子家族中的成员，在胚胎发育中调控细胞的增殖、迁移和定向型分化。PAX3在多种肿瘤中的表达升高并且具有癌基因的特性，然而PAX3在胃癌中研究尚属空白。那么，PAX3的表达是否与胃癌的转移相关？PAX3在胃癌中的作用如何？PAX3的上下游调控分子及机制是什么？这些问题都需要逐一探讨。【目的】1、明确PAX3在胃癌转移细胞系及组织中的表达，并探讨PAX3对胃癌转移的影响；2、研究PAX3的上游microRNA调控分子及调控机制；3、研究PAX3调控胃癌转移的下游分子事件。【方法】利用体外Transwell迁移和侵袭实验、裸鼠尾静脉注射体内转移实验对各细胞亚系的侵袭和转移能力进行鉴定；通过WST-1、裸鼠体内成瘤实验检测各细胞亚系的体内外增殖能力；流式细胞仪检测各细胞亚系周期；采用高通量转录因子活性谱芯片检测不同转移潜能的胃癌细胞亚系的转录因子活性谱差异，筛选出胃癌转移相关的转录因子。应用免疫组化检测PAX3在胃癌组织、癌旁正常胃粘膜及淋巴结转组织中的表达；Western blot检测PAX3在胃癌不同转移潜能细胞亚系中的表达；构建PAX3过表达及siRNA慢病毒载体，分别转染各细胞亚系建立稳转细胞系；体外Transwell迁移和侵袭实验、裸鼠体内转移实验检测PAX3对胃癌转移能力的影响。应用荧光素酶报告基因实验验证miR-206对PAX3的调控作用；Real-time PCR检测miR-206与PAX3在胃癌组织和细胞系中表达，分析二者的表达相关性；miR-206的类似物和抑制物转染细胞后，Real-time PCR和Western blot检测PAX3的mRNA和蛋白水平的改变，进一步验证miR-206对PAX3的调控作用；miR-206的类似物和抑制物转染细胞后体外转移实验检测miR-206对胃癌转移的影响；miR-206慢病毒表达载体转染细胞后体内转移实验检测miR-206对胃癌转移的影响；转染miR-206慢病毒表达载体后，共转染或不转染PAX3载体，体内外转移实验检测miR-206是否通过调控PAX3而影响胃癌的转移。采用双荧光素报告基因实验检测PAX3对MET启动子活性的影响；PAX3过表达及siRNA慢病毒载体转染细胞后，Real-time PCR和Western blot检测PAX3的mRNA和蛋白水平的改变，免疫荧光检测PAX3和MET的表达与定位；免疫组化检测MET在胃癌组织中的表达，分析PAX3与MET表达的相关性。【结果】体内外转移实验结果表明，MKN28-M，SGC7901-M细胞亚系的侵袭、转移能力明显高于MKN28-NM，SGC7901-NM细胞亚系，而细胞的增殖及细胞周期没有明显差别；转录因子活性谱表芯片结果发现，与低转移潜能细胞亚系相比，有15个转录子在高转移潜能细胞亚系中的活性显著升高（>2倍），而有32个转录因子的活性明显降低，其中PAX3活性升高的较为显著，且与细胞的迁移、运动功能密切相关；免疫组化结果显示，PAX3在大多数（64%）胃癌组织中的细胞核中表达明显升高，而在癌旁组织中不表达或在胞浆中弱表达，PAX3的表达与临床分期、淋巴结转移相关；并且PAX3在多数（57.5%）淋巴结转移组织中的表达明显高于相应的原发灶；Kaplan-Meier生存分析提示，PAX3表达阳性的胃癌病人术后生存时间明显低于PAX3阴性表达的病人（P=0.023），多因素COX回归分析进一步表明淋巴结转移、TNM分期、PAX3表达可作为胃癌患者不良预后的独立因素；Western bolt结果表明，高转移细胞亚系的PAX3表达明显高于低转移细胞亚系；在高转移细胞系中下调PAX3的表达后，细胞体内外的侵袭和转移能力明显减弱，在低转移细胞系中上调PAX3的表达后，细胞的转移能力明显增强。荧光素报告基因实验证实miR-206结合于PAX3的3’UTR区域，从而抑制荧光素酶的活性，miR-206不影响结合位点突变型的3’UTR的荧光素酶活性；Real-timeRCR检测了miR-206和PAX3在胃癌组织及不同转移潜能的细胞中的表达，结果表明miR-206的表达在高转移潜能的细胞系MKN28-M、SGC7901-M中相对较低，而在低转移细胞系MKN28-NM、SGC7901-NM中相对较高，与PAX3正好相反；并且，miR-206与PAX3在胃癌组织中的表达呈明显的负相关；细胞转染了miR-206的类似物后，PAX3的蛋白水平明显下降，而转染了miR-206的抑制物后，PAX3的蛋白表达升高；建立miR-206功能获得和缺失模型，体内外功能学实验证实，miR-206可抑制胃癌细胞的转移，其是通过下调PAX3的表达而发挥作用。荧光素报告基因实验结果显示PAX3可激活MET的启动子活性，在PAX3表达较低的低转移细胞系上调PAX3的表达后，Real-time PCR、Western blot结果显示MET的mRNA和蛋白表达水平明显升高，在PAX3高表达的高转移细胞系中下调PAX3的表达后，MET的mRNA和蛋白水平随之降低，免疫荧光结果类似。免疫组化检测MET在胃癌组织中表达发现，MET在70.7%的胃癌组织中高表达且定位于胞膜上，MET的表达与临床分期、淋巴结转移相关；PAX3与MET在胃癌组织中的表达呈明显的正相关（P<0.05），并且，MET和PAX3双阳性表达组的胃癌病人术后生存时间明显低于单阳性表达或双阴性表达组。【结论】PAX3在胃癌中的表达明显升高且与转移相关，其上游受到miR-206的负性调控，下游转录激活MET的表达从而促进胃癌细胞的侵袭和转移，因此，miR-206-PAX3-MET信号通路有望拓展我们对胃癌转移分子调控机制的认识，为胃癌转移的治疗提供新的干预靶点。