【摘 要】
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聚酰胺胺（Poly（amino amine）s,PAAs）作为一类非病毒基因载体在近年来受到了研究者们的广泛关注,该类基因载体是由具有酰胺单体和胺单体的两类化合物通过迈克尔加成反应一步合成的一种拟肽聚合物。其中,具有二硫键的酰胺单体与胺单体反应合成的PAAs是一种更具优势的PAAs,这类PAAs又被称为聚二硫胺（Poly（disulfide amine）,SS-PAAs）。一种以N,N’-胱胺双丙
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聚酰胺胺（Poly（amino amine）s,PAAs）作为一类非病毒基因载体在近年来受到了研究者们的广泛关注,该类基因载体是由具有酰胺单体和胺单体的两类化合物通过迈克尔加成反应一步合成的一种拟肽聚合物。其中,具有二硫键的酰胺单体与胺单体反应合成的PAAs是一种更具优势的PAAs,这类PAAs又被称为聚二硫胺（Poly（disulfide amine）,SS-PAAs）。一种以N,N’-胱胺双丙烯酰胺（N,N’-cystaminebisacrylamide,CBA）为酰胺单体,N-Boc-1,6-二氨基己烷（N-Boc-1,6-hexanediamine,N-Boc-1,6-DAH）为胺单体的SS-PAAs（p（CBA-DAH））,是SS-PAAs家族中具有代表性的聚合物,表现出较高的DNA转染能力。目的:本研究将具有血清耐受性、无毒性作用的富含吡咯烷酮基的聚乙烯基吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone,PVP）按照一定比例修饰到p（CBA-DAH）的侧链氨基上,在降低p（CBA-DAH）对细胞的毒性的同时,改善其对血清的耐受性。将含吡咯烷酮基团的N-（3’-丙胺基）-2-吡咯烷酮（N-（3’-Aminopropyl）-2-pyrrolidinone,APP）作为胺单体与CBA反应生成主链上含吡咯烷酮基的SS-PAAs,以评价这两种含吡咯烷酮的SS-PAAs作为基因载体时在性能方面的差异性。方法:（1）通过迈克尔加成反应合成聚合物p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）,利用RAFT聚合反应合成分子量确定的具有功能性基团的PVP-COOH;将p（CBA-DAH）的末端氨基与PVP-COOH的羧基反应合成聚合物p（CBA-DAH）-g-PVP,并对各聚合物进行红外光谱（Infrared Spectroscopy,IR）和核磁共振氢谱（Proton nuclear magnetic resonance,1H-NMR）的表征。（2）p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）和p（CBA-DAH）-g-PVP压缩和释放DNA的能力利用凝胶电泳实验和粒度仪进行考察;各聚合物的缓冲能力采用p H酸度计进行考察。（3）采用MTT法考察不同浓度的聚合物以及不同重量比的聚合物/DNA复合物对Bel-7402、He La、Hep G2和NIH3T3细胞的毒性研究;利用DNA Ladder实验和Annexin V-FITC/PI双染法实验考察聚合物对Bel-7402细胞的凋亡情况;利用倒置荧光显微镜和流式细胞术考察聚合物在不同重量比、不同细胞系以及有无血清的条件下对DNA的转染能力;运用细胞通道抑制剂处理细胞的方法和荧光标记染色法对聚合物将目标DNA递送至Bel-7402细胞中的机制进行研究。结果:成功合成了p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）、p（CBA-DAH）-g-PVP聚合物并进行了结构表征。各聚合物p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）、p（CBA-DAH）-g-PVP分别与DNA形成复合物,在重量比为3:1、2:1和3:1时能完全压缩DNA,并且各复合物经谷胱甘肽和十二烷基磺酸钠处理后均能释放出DNA。主链和侧链结构中吡咯烷酮基的引入大大降低了聚合物对细胞的毒性,其对细胞的毒性依次为:p（CBA-APP）<p（CBA-DAH）-g-PVP<p（CBA-DAH）<PEI 25 k Da,且上述聚合物均不能诱导Bel-7402细胞凋亡。p（CBA-APP）和p（CBA-DAH）-g-PVP均能将DNA转染到Bel-7402、He La、Hep G2和NIH3T3细胞中,用荧光显微镜就能观察到绿色荧光蛋白的表达。p（CBA-DAH）-g-PVP/DNA重量比为9:1时在Bel-7402细胞中的转染效率为36.63%,与阳性对照PEI 25k Da/DNA重量比为1:1时的转染效率（37.91%）无显著性差异。p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）和p（CBA-DAH）-g-PVP均是通过网格蛋白依赖的内吞途径将目标DNA递送至Bel-7402细胞中,并经溶酶体逃逸后进入细胞核。结论:作为基因载体材料,p（CBA-DAH）、p（CBA-DAH）-g-PVP和p（CBA-APP）均具有良好的物理化学性能和生物特性。与p（CBA-DAH）相比,含吡咯烷酮基的p（CBA-DAH）-g-PVP和p（CBA-APP）均表现出较好的DNA压缩能力和较低的细胞毒性,尤其是侧链引入吡咯烷酮基的p（CBA-DAH）-g-PVP。PVP的引入虽然使p（CBA-DAH）对DNA的转染能力有所降低,但在Bel-7402细胞中,最优重量比的p（CBA-DAH）-g-PVP对DNA的转染能力与PEI 25 k Da相似。综上,p（CBA-DAH）-g-PVP可以作为一种优良的基因载体继续进行研究。
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